(四川輕化工大學(xué) 四川 涼山州 615500)

一、研究?jī)?nèi)容

通過(guò)培養(yǎng)，誘變，篩選得到高產(chǎn)黑莓菌株，得到糖化酶。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

(一)實(shí)驗(yàn)菌株

從某菌種保藏中心得到黑曲霉。

(二)培養(yǎng)基

CDM固體培養(yǎng)基(L): 30g(蔗糖)、3g NaNO3)、1g(KH2PO4)、0.5g MgSO4).0.5g(KC1)、0.01g(FeSO47H2O)、20g(瓊脂)、pH5.4,在條件0.1MPa,121℃下滅菌20min.

種子培養(yǎng)基(g/L): 120g(玉米淀粉)、20g(豆餅粉)、20g(玉米漿)、0.5g(CaCl).pH5.0,在條件0.1MPa,121℃下滅菌20min.

發(fā)酵(復(fù)篩)培養(yǎng)基(L): 250g(玉米淀粉).40g(豆餅粉).40g(玉米漿)、2g(NH4CI)、0.5g(CaCl2)、pH5.1,在條件0.1MPa,121℃下滅菌20min。

(在發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配置過(guò)程中，都是先加入玉米淀粉和豆餅粉，加一定量的蒸餾水溶解，加入高淀酶20000U/mL)達(dá)到20 U/mL,90℃水浴10min,達(dá)到液化，加入玉米漿溶解，調(diào)pH再滅菌)

初篩培養(yǎng)基(g/L): 10g(蔗糖)、12g(可溶性淀粉)、3g(NaNO3,)、1g(KHPO4)、0.5g(MgSO4)、0.5g(KC1)、0.01g(FeSO47H2O).20g(瓊脂)、pH5.0,在條件0.1MPa,121℃下滅菌20min.

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L): 1g(葡萄糖)、12g(可溶性淀粉)、3g(NaNO3;)、1g(KH2PO4)、0.5g(CaCl2)、pH5.0， 在條件0.1MPa，121℃下滅菌20min.

(三)主要試劑

85%的無(wú)菌生理鹽水:稱取NaCl固體8.5g于燒杯中，溶于少量蒸餾水，轉(zhuǎn)移至1000mL的容量瓶中定容，在條件0.1MPa，121℃ 下滅菌20min,保存?zhèn)溆茫?.5mol/L NaS2O3溶液:稱取4.76g NaS2O3固體溶于少量蒸餾水，轉(zhuǎn)移至1000mL的容量瓶中定容，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

魯氏碘液:稱取2.0g KI溶于5mL蒸餾水中，加入1.0g I2,50℃水浴中稍微加熱溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容，棕色瓶中避光保存。

2%DES溶液:取DES原液0.4mL于無(wú)菌的、帶有刻度的試管中，加入0.6mL乙醇使其溶解，在加19mL pH7.2的磷酸緩沖液，配成體積分?jǐn)?shù)為2%的DES溶液。

2mol/L NaOH溶液:用燒杯稱取80g NaOH固體，用少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中定容，4C保存?zhèn)溆谩?/p>

DNS溶液:稱取6.3g DNS于1000mL燒杯中，加500mL蒸餾水，45℃水浴:稱取182g酒石酸鉀鈉溶于少量蒸餾水中，加入上述溶液中，把燒杯置于磁力攪拌器上，緩慢的加入2mo/L NaOH溶液262mL,直至溶液清澈透明，加入Sg茉酚和5g無(wú)水亞硫酸鈉，轉(zhuǎn)移至000mL容量瓶中定容，棕色瓶避光保存7d后使用。

0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.6);稱取1.34g 三水合乙酸鈉溶于少量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至200mL的容量瓶中定容，用冰酷酸調(diào)pH至4.6,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2%可溶性淀粉:稱取含4g可溶性淀粉溶于少量蒸餾水中，加入到100mL已煮沸的蒸餾水中，繼續(xù)煮沸直至透明，加20mL 0.05mol/L pH4.6醋酸醋酸鈉緩沖液,轉(zhuǎn)移至200mL的容量瓶中定容，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(四)主要儀器

水浴鍋HH-2A；無(wú)菌操作臺(tái)SW-C-2FD；全溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-F280；生化培養(yǎng)箱HPS-280；干燥箱BON-IS0；

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)FE20；小型臺(tái)式圖心機(jī)AllgM17；電子天平AL104；托盤天平PL602-S；磁力加熱攪拌器79-1；

可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-7504V；立式高壓滅菌鍋GR60DA；

三、實(shí)驗(yàn)方法

(一)菌種的保存與活化

菌種的保存:取lmL加入了黑曲霉的孢子懸浮液與1mL無(wú)菌50%甘油加入2mL無(wú)菌的EP管中混勻，保存在-80℃的冰箱中。

菌種的活化:將-80℃冰箱中保存的菌種于CDM固體培養(yǎng)基上劃平板，30℃恒溫培養(yǎng)3d,挑選單菌落用同樣的方法連續(xù)活化2代。

定期傳代法:將長(zhǎng)滿黑曲霉菌株的培養(yǎng)基保存在4℃的冰箱中，每隔1個(gè)月傳代一次。

(二)孢子懸浮液的制備

用無(wú)菌的生理鹽水將連續(xù)活化培養(yǎng)2代的黑曲霉成熟的孢子從CDM固體培養(yǎng)基上洗脫下來(lái)，加入30顆無(wú)菌的玻璃珠(d=3mm),30℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)lh,是菌絲分散開來(lái)，用4層無(wú)菌的紗布過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)，用無(wú)菌的生理鹽水稀釋-定的倍數(shù)，使孢子懸浮液濃度為106-108個(gè)/mL,即為單胞子懸浮液。

(三)粗酶液的制備

將30℃，200rpm 振蕩培養(yǎng)5d后的發(fā)酵液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，800rpm 離心10min,上清液即為粗酶液。

(四)酶活力的測(cè)定方法(DNS法)

1.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的制備

標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液(lmg/mL)的配制:稱取105C下干燥至恒重的葡萄糖0.1g,用少量蒸餾水溶解，定容至100mL的容量瓶中，搖勻，4℃保存?zhèn)溆?。在已?biāo)好號(hào)的0-7號(hào)試管中按表2.1加入，混合均勻后在沸水浴中加熱5min,立即用流水冷卻，補(bǔ)加9mL蒸餾水，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm下測(cè)吸光度。并繪制標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖曲線。

2.糖化酶酶活的測(cè)定

吸取1mL粗酶液稀釋1000倍，待測(cè)。取一只試管，分別加入5mL 2%的可溶性淀粉和4mL 0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.6),搖勻，于40℃水浴中預(yù)熱10min,往試管中加入1ml稀釋的粗酶液，損勻，40C水浴中反應(yīng)10min后(反應(yīng)過(guò)程中每隔1min混勻一次),立即沸水浴10min停止反應(yīng).吸取1mL反應(yīng)液，0.5mL水,2mLDNS溶液，沸水浴5min,立即用流水冷卻，補(bǔ)加9mL水，搖勻,紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm處測(cè)定其吸光度值。以不加酶的反應(yīng)液做空白對(duì)照。

(五)菌種誘變

1.紫外誘變致死率

無(wú)菌操作臺(tái)的紫外燈開20min以上，使其波長(zhǎng)穩(wěn)定。預(yù)備8個(gè)無(wú)菌的培養(yǎng)皿，吸取5mL已出芽的孢子懸浮液于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿重直置于紫外燈下，分別照射0-7min(每隔30s搖勻一次)，吸取上述照射過(guò)的懸浮液各1mL,用無(wú)菌水按10-1、10-2、10-3等3個(gè)梯度稀釋，分別吸取100μL的各濃度稀釋液涂布于CDM平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3d,計(jì)算茵落數(shù)，以0min(即未經(jīng)處理的)做對(duì)照組，繪制曲線。

2.DES誘變致死率

取2%的DES溶液和已出芽的孢子懸浮液各5mL,分別加入到7支無(wú)菌的帶塞試管中，置于30℃,200pm的搖床上,振蕩處理0-60min,再加入2mL,0.5mol/LNa2S2O3溶液終止反應(yīng)。分別吸取上述處理液各1mL,用無(wú)菌水按10-1、10-2.10-3等3個(gè)梯度稀釋，分別取100uL的各濃度稀釋液涂布于CDM平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3d，計(jì)算菌落數(shù)，以0min(即未經(jīng)處理的)做對(duì)照組，繪制曲線。

3.致死率的計(jì)算

致死率(%)=(對(duì)照皿的菌落總數(shù)-處理后的菌落總數(shù))/對(duì)照皿的菌落總數(shù)x100%

4.復(fù)合誘變

取孢子懸浮液5mL,稀釋至10-3，按1.2.5.1和1.2.5.2中得出的紫外誘變和DES誘變的合適條件進(jìn)行結(jié)合誘變處理。

(六)初篩及復(fù)篩

將經(jīng)過(guò)紫外和DES復(fù)合誘變處理后的孢子懸浮液，取100uL涂布于CDM培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3d后，挑取10個(gè)單菌落點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基的正中央，30℃恒溫培養(yǎng)3d,滴加魯氏碘液，挑選出5個(gè)透明圈較大的單菌落，分別接入50mL,發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中，30℃，200rpm 振蕩培養(yǎng)5d,測(cè)第二次酶活。

(七)穩(wěn)定性遺傳實(shí)驗(yàn)

從復(fù)篩的5個(gè)菌株中選取酶活力最高的菌株在CDM培養(yǎng)基上連續(xù)傳代8次，每代都挑選成熟的孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，5d后測(cè)酶活。選取復(fù)合誘變篩選出來(lái)的酶活最高的菌株MS

(八)酶制備

用無(wú)菌的生理鹽水將黑曲霉菌株MS從CDM固體培養(yǎng)基洗脫下來(lái)，加入30顆無(wú)菌的玻璃珠(d=3mm),30℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)lh,使菌絲分散開來(lái)，用4層無(wú)菌的紗布過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)，用無(wú)菌的生理鹽水稀釋-定的倍數(shù)，使孢子懸浮液濃度為106-108個(gè)/mL,即為單胞子懸浮液。

將30℃，200rpm 振蕩培養(yǎng)5d后的發(fā)酵液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，800rpm 離心10min,上清液即為粗酶液。