許晨新，趙圓圓，李亞俊，馬圓媛，吳夢(mèng)茹，劉文杰，吳 潔，張海江*

(1. 淮陰工學(xué)院 江蘇省特色資源開發(fā)與藥用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003；2.濰坊市康華生物技術(shù)有限公司，山東 濰坊 2610213；3. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，南京 211800)

威靈仙為毛莨科植物威靈仙ClematidisRadixchinensisOsbeck.、棉團(tuán)鐵線蓮ClematidisRadixhexapetalaPall.、東北鐵線蓮ClematidisRadixmanshuricaRupr.的干燥根及根莖[1]，臨床用于風(fēng)濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利。市場(chǎng)上的威靈仙主要產(chǎn)于安徽、東北、朝鮮等地。威靈仙中化學(xué)成分復(fù)雜[2]，主要包括三萜皂苷、黃酮、香豆素、生物堿等。有研究發(fā)現(xiàn)，在東北鐵線蓮中含有5-羥甲基糠醛(5-HMF)[3-4]。5-HMF是葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的一個(gè)醛類化合物，是大多數(shù)中藥煎煮后或加工炮制后的共性成分[5]。由于該化合物對(duì)人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害，因此有必要測(cè)定其含量進(jìn)行中藥材及其飲片的質(zhì)量控制[6-10]。本研究基于威靈仙臨床水煎的提取方法，研究建立不同產(chǎn)地、基原威靈仙水煎液中5-HMF的HPLC含量測(cè)定方法，并探究5-HMF生成機(jī)制，以期為威靈仙提取方法的改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(G1379A型脫氣機(jī)，G1311A型四元泵、G1313A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1315B型DAD檢測(cè)器)；FA2004型電子天平(上海圖新電子科技有限公司)；Q/320683AFA02-2005型調(diào)溫電熱器(上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Allegra X-30型多功能臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；歌能G-100S型超聲波清洗機(jī)超聲清洗儀(深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司)；JP-100A-2型高速多功能粉粹機(jī)(上海市久品工貿(mào)有限公司)；TS-DI10-L/H型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(陶氏水處理設(shè)備工程有限公司)。

1.2 試藥

威靈仙藥材購于安徽亳州藥材市場(chǎng)，共計(jì)4個(gè)產(chǎn)地，6個(gè)批次，分別為安徽1批次、遼寧2批次、東北2批次、朝鮮1批次。藥材由本實(shí)驗(yàn)室鑒別，其中威靈仙1批次，棉團(tuán)鐵線蓮1批次，東北鐵線蓮4批次(見表1)。各藥材樣品均保存于本實(shí)驗(yàn)室；5-HMF對(duì)照品購于上海麥克林生化科技有限公司(批號(hào)C10076829)，乙腈(色譜純)，D101型大孔吸附樹脂，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其他試劑均為分析純。

表1 中藥材威靈仙的來源及基原鑒別

1.3 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18柱(天津博納艾杰爾科技有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈- 0.5%HAC(5.5:94.5，V/V)等度洗脫；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取5-HMF對(duì)照品105.3 mg，至100 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成1.053 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.5 供試品制備

1.5.1回流提取

取威靈仙藥材粉末(過5號(hào)篩)約10 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，按照正交試驗(yàn)最佳工藝共提取3次，合并提取液，離心，過濾，至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，得供試品溶液。

1.5.2超聲提取

取威靈仙藥材粉末(過5號(hào)篩)約20 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入水溶液200 mL，常溫下超聲提取，每次30 min，共提取2次，合并提取液，離心，取上清液，得到超聲水提液。取適量水提液低溫濃縮后，凍干得到超聲凍干物。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化

表2 回流提取L9(43)正交試驗(yàn)

表3 回流提取正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液、回流提取供試品溶液和超聲提取水提液適量，按色譜條件進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果表明，5-HMF保留時(shí)間為9.27 min，分離度大于1.5；理論板數(shù)大于4000。超聲提取液中未檢測(cè)到5-HMF(見圖1)。

A:5-HMF對(duì)照品；B:威靈仙加熱回流供試品；C:威靈仙超聲水提供試品；1：5-HMF。

2.2.2線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，以水逐級(jí)稀釋得到21.0530～0.3508 μg· mL-1的對(duì)照品系列溶液。按色譜條件分析，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸分析，得方程為Y=149.69 X-7.5183，R2=0.9999。結(jié)果表明，5-HMF在0.3508 ～ 21.053 μg· mL-1的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3檢測(cè)限與定量限

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，逐級(jí)稀釋后按色譜條件分析，測(cè)得檢測(cè)限為0.09 μg· mL-1，定量限為0.30 μg· mL-1。

2.2.4精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品儲(chǔ)備液20 μL，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得5-HMF峰面積的RSD為0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(產(chǎn)地安徽)，分別在0、2、4、6、8、10 h按色譜項(xiàng)條件分析，測(cè)得峰面積 RSD為1.2%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批威靈仙樣品(產(chǎn)地安徽)，按回流提取制備方法平行6份，按色譜條件分析，記錄色譜峰面積， RSD為2.2%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量威靈仙藥材粉末(產(chǎn)地安徽)9份，每份10 g，每3份分別精密加入1 mg· mL-1的

5-HMF溶液1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL，按回流提取制備方法制備，平均加樣回收率為99.8%，RSD為1.2%(見表4)。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 5-HMF樣品含量測(cè)定

各產(chǎn)地的威靈仙藥材樣品分別按照回流提取方法制備供試品溶液，經(jīng)色譜條件測(cè)定，各產(chǎn)地威靈仙藥材中的5-HMF含量結(jié)果表明，不同產(chǎn)地和基原的藥材水煎液中5-HMF含量有所差異，棉團(tuán)鐵線蓮含量>威靈仙>東北鐵線蓮，其中棉團(tuán)鐵線蓮含量最高達(dá)到0.2116 mg·g-1，東北鐵線蓮含量最低0.0148 mg·g-1，兩者相差約15倍。

表5 不同產(chǎn)地威靈仙中的5-HMF含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1，n=6)

2.4 生成機(jī)制研究

2.4.1大孔樹脂流分的分析

2.4.1.1 大孔樹脂的分離

取超聲提取下的水提液，加入預(yù)處理好的D101型大孔吸附樹脂，靜態(tài)吸附3 h后，依次用200 mL去離子水、200 mL95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液，減壓濃縮，得水洗流分和95%乙醇流分，分別定容至200 mL。采用顯色反應(yīng)鑒定流分中的成分類別，顯色反應(yīng)類型及現(xiàn)象見表6。

表6 各流分的成分種類鑒別

結(jié)果顯示，水洗流分對(duì)苯酚-硫酸反應(yīng)、銀鏡反應(yīng)、斐林反應(yīng)呈陽性，對(duì)醋酐-濃硫酸反應(yīng)和鹽酸-鎂粉反應(yīng)為陰性，而95%乙醇流分則相反。表明，水洗流分中的主要成分包含還原性多糖，不含皂苷和黃酮；95%乙醇流分中含有皂苷類和黃酮類化合物，不含糖類成分。

2.4.1.2 流分加熱回流

取“2.4.1.1”項(xiàng)下10 mL水洗流分、10 mL 95%醇洗流分分別放入25 mL圓底燒瓶中，平行3份，分別于60℃、80℃、100℃加熱回流1 h，將樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，分別定容至10 mL，進(jìn)行色譜條件分析。結(jié)果表明，水洗流分經(jīng)100℃回流后產(chǎn)生5-HMF，且含量與表4結(jié)果基本一致，并且提取溫度是影響5-HMF含量的關(guān)鍵因素，與2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。醇洗流分不產(chǎn)生5-HMF，這說明威靈仙中的5-HMF主要由糖類物質(zhì)降解產(chǎn)生。(見圖2、表7)。

水洗流分：A.100℃；B.80℃；C.60℃；醇洗流分：D.100℃；E. 80℃；F. 60℃；1∶5-HMF。

流分流分中的5-HMF含量/(μg·mL-1)換算為生藥材中的5-HMF含量/(mg·g-1)100℃80℃60℃100℃80℃60℃水洗16.561.050.260.160.010.0026醇洗0.64——0.0064——

2.4.2水提醇沉部位分析

取超聲提取的超聲凍干物平行2份，分別加入70%乙醇和無水乙醇，超聲溶解后分離上清液和沉淀。采用顯色反應(yīng)鑒定水提醇沉各部位的成分類別，結(jié)果見表8。分別取適量70%醇沉和100%醇沉部分的上清液和沉淀，加入適量純化水，在100℃下的加熱回流6 h，將樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，按色譜條件分析，結(jié)果見圖3。

A：70% ETOH上清液；B：70% ETOH沉淀；C：100% ETOH上清液：D：100% ETOH沉淀；5-HMF。

表8結(jié)果顯示，70%醇沉上清液對(duì)銀鏡反應(yīng)、斐林反應(yīng)呈陽性，對(duì)苯酚-硫酸反應(yīng)呈陰性，而70%醇沉沉淀則相反；70%醇沉上清液主要是還原性寡糖，而沉淀中的多糖類成分為非還原性多糖。100%醇沉上清液均呈陰性反應(yīng)，100%醇沉沉淀則相反，表明100%醇沉上清液不含糖，其沉淀為多糖類成分。

表8 醇沉各部位的成分種類鑒別

由圖3可知， 70%醇沉上清液加熱后產(chǎn)生大量5-HMF，沉淀未產(chǎn)生5-HMF，而100%醇沉結(jié)果相反，說明5-HMF主要由還原性寡糖產(chǎn)生。

3 結(jié)論

本研究比較了水回流提取和超聲提取，結(jié)果表明，超聲提取未產(chǎn)生5-HMF，水回流提取產(chǎn)生5-HMF，且溫度是其產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定回流提取的最佳提取工藝參數(shù)。

本研究建立了威靈仙中5-HMF的HPLC含量測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確。將之應(yīng)用于考察回流提取工藝條件對(duì)5-HMF含量的影響，并探究5-HMF的來源。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-HMF主要是由威靈仙中的還原性寡糖降解產(chǎn)生，提取溫度是影響威靈仙提取物中5-HMF含量的關(guān)鍵因素。在100℃提取溫度下，不同產(chǎn)地威靈仙的煎煮液中均檢測(cè)含有5-HMF，含量范圍為0.0148～0.2116 mg·g-1，含量最高相差15倍。由于威靈仙臨床多為煎煮后入藥，因此煎煮液中必然含有一定量的5-HMF為患者所服用。為有效避免煎煮過程中產(chǎn)生5-HMF，保障用藥安全，建議降低威靈仙的煎煮溫度至60℃左右。