王國平，鮑志娟，許鵬

(1.浙江大洋生物科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 311616； 2.浙江大洋科技鉀鹽企業(yè)研究院，浙江 杭州 311616)

恩拉霉素(enramycin)，又名持久霉素，是由放線菌發(fā)酵而得，包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機(jī)堿，可作用于細(xì)菌的裂殖階段，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。恩拉霉素對腸內(nèi)有害梭狀芽孢桿菌抑制力很強(qiáng)、長期使用后無抗藥性，通過改變腸道內(nèi)的細(xì)菌群，促進(jìn)動物對飼料中營養(yǎng)成分的利用效果，提高豬、雞增重和飼料轉(zhuǎn)化率，且不會通過腸道吸收，對農(nóng)作物、魚類和環(huán)境無毒無害，是目前最為安全、有效的動物專用抗生素。

核輻射具有穿透能力強(qiáng)、不升高產(chǎn)品溫度、適合包裝密封物品、不耐熱物品等優(yōu)點(diǎn)，滅菌效果安全可靠，常用于中西藥制劑和食品滅菌[1-5]。美國等國家已批準(zhǔn)核輻射技術(shù)用于飼料及飼料原料防霉，并在農(nóng)牧水產(chǎn)飼料生產(chǎn)部門進(jìn)行推廣應(yīng)用，中國也有針對輻射對飼料影響的研究報道[6]。本試驗(yàn)通過比較不同輻射劑量對恩拉霉素滅菌效果及穩(wěn)定性的影響，旨在探究輻射滅菌對恩拉霉素的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

8%恩拉霉素預(yù)混劑由浙江大洋生物科技集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，采用聚丙烯內(nèi)袋和編織外袋包裝，每袋25 kg。恩拉霉素對照品，含量98.1%，由美國BOC SCIENCES公司提供，批號B13Z0912。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，高鹽察氏培養(yǎng)基(硝酸鈉2 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，氯化鈉60 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL)，伊紅美藍(lán)瓊脂(蛋白胨10 g，乳糖10 g，磷酸二氫鉀2 g，伊紅0.4 g，美藍(lán)0.065 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.3)，北京三藥科技開發(fā)公司提供。

甲醇、乙腈，均為色譜純，購自美國天地有限公司；丙酮、鹽酸、磷酸、磷酸二氫鈉、重鉻酸鉀，均為國產(chǎn)分析純，由南京化學(xué)試劑廠提供。

1.1.2 儀器及設(shè)備

Waters高效液相色譜儀(1525二元高壓梯度泵、2487紫外雙波長檢測器，Sunfire C18分析柱，Breeze工作站)，高速臺式離心機(jī)(Sigma 1-15K)，超凈工作臺(HZC-1209C，上海智城)，全溫?fù)u床(HZD-50R，江蘇華利達(dá))，高壓滅菌鍋(LEDX-40BⅠ)，pH測定儀(METTLER TOLEDO 320)，電子天平(BS2233)，紫外分光光度計(jì)(島津UV-1800)，劑量計(jì)，鈷-60(60Co，浙江輻照中心提供，源強(qiáng)4.8萬Ci)。

1.2 輻射滅菌劑量確定

設(shè)空白對照組和12個不同劑量級別的輻射組，每組3袋樣品。所用樣品均為同批次生產(chǎn)，分裝于100 g規(guī)格的鋁箔袋中，并熱熔封口。樣品置于臺板上，距離輻射源100 cm，輻射組分別以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 kGy吸收劑量照射(以實(shí)際測量值為準(zhǔn))。

輻射后的樣品保存于室溫，對照組不作滅菌處理。然后按照中國藥典(2015版)、GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)測定》、GB/T 13093—2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》方法，檢測樣品中的霉菌、細(xì)菌和大腸埃希菌數(shù)，微生物培養(yǎng)為陰性的輻射劑量為有效滅菌劑量。

1.3 高效液相色譜法測定恩拉霉素降解率

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取恩拉霉素對照品，置于50 mL容量瓶中，用提取液(丙酮∶1 mol·L-1鹽酸∶水為350∶120∶560，V/V)溶解，定容至刻度，振搖使均勻，制備20 mg·mL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用pH 4.5磷酸二氫鉀緩沖液稀釋成約2 mg·mL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后備用。

1.3.2 樣品溶液的配制

精密稱定不同輻射劑量處理后的樣品1.0 g置50 mL容量瓶中，加入提取液約40 mL，超聲40 min，靜置冷卻至室溫后，用提取液定容至刻度，混勻后3 500 r·min-1離心5～10 min，取上清液于樣品瓶中備用。吸取清液用pH 4.5磷酸二氫鉀緩沖液稀釋成約2 mg·mL-1濃度，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后待測。

1.3.3 高效液相色譜條件

流動相：乙腈∶0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(30∶70，V/V)；柱溫35 ℃；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL·min-1。

1.3.4 進(jìn)樣測試

在上述液相色譜條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)品工作液，直至相鄰2針的相對響應(yīng)變化值小于1.0%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。供試品色譜峰的保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰的保留時間一致。

1.4 最佳輻射劑量的放大驗(yàn)證

根據(jù)小試樣品的輻射劑量、滅菌效果及恩拉霉素的降解情況，優(yōu)選出最佳劑量。在此輻射劑量下，將6個批次的恩拉霉素產(chǎn)品進(jìn)行輻射，每組6個樣品，貯存于室溫庫房中，濕度40%～70%，分別于輻射后0、30、60、120、180、360 d取樣測試微生物指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co不同輻射劑量下的滅菌效果

如表1所示，隨著60Co輻射滅菌劑量的增加，滅菌效果隨之提高。輻射劑量達(dá)到3 kGy時，霉菌、細(xì)菌和大腸埃希菌均已全部滅殺(圖1)。

表1 不同輻射劑量輻射后恩拉霉素預(yù)混劑中微生物指標(biāo)

2.2 60Co不同輻射劑量下恩拉霉素的降解率

如表2所示，60Co輻射會導(dǎo)致恩拉霉素降解，隨著輻射劑量的增加，降解率隨之增長。輻射劑量低于3 kGy時，恩拉霉素降解率低于2%；輻射劑量超過8 kGy時，降解率明顯提高。

2.3 60Co最佳輻射劑量下產(chǎn)品的貯存期

根據(jù)以上的研究結(jié)果，考慮到大規(guī)模的輻射與小樣的差異性，將恩拉霉素產(chǎn)品的輻射劑量定為4 kGy。

如表3所示，在4 kGy輻射劑量下，3個批次的恩拉霉素輻射后貯存于室溫庫房中，保存0、30、60、120、180、360 d后的微生物指標(biāo)均符合相關(guān)限量要求，說明采用60Co輻射滅菌方式可行，輻射后貯存期可超過1年。

A～D—分別為輻射前、輻射劑量1、2、3 kGy處理后樣品的細(xì)菌培養(yǎng)情況；E～H—分別為輻射前、輻射劑量1、2、3 kGy處理后樣品的霉菌培養(yǎng)情況。圖1 輻射前后恩拉霉素微生物培養(yǎng)情況

表2 不同輻射劑量下恩拉霉素降解情況

表3 4 kGy輻射劑量輻射后恩拉霉素預(yù)混劑相關(guān)指標(biāo)

3 小結(jié)

恩拉霉素預(yù)混劑采用60Co輻射滅菌方式可行，滅菌效果穩(wěn)定可靠，且不會影響恩拉霉素的貯存穩(wěn)定性，可延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。輻射劑量對于滅菌效果和恩拉霉素降解率呈正相關(guān)性，4 kGy輻射劑量下，可將細(xì)菌和霉素全部殺滅，恩拉霉素降解率小于2%。