暴 鵬,李 雪,孫麗莎,張曉冉,楊欣怡,李朝敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,成都 610075;*通訊作者,E-mail:Chenyi80066545@163.com)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病患者主要并發(fā)癥之一,主要臨床表現(xiàn)為觸誘疼痛、四肢異常性疼痛、痛覺過敏等感覺和自主神經(jīng)癥狀[1]。糖尿病患者中發(fā)病時(shí)間超過10年的,DPN發(fā)病率高達(dá)90%,致殘率極高,嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[2]。補(bǔ)陽還五湯(Buyang Huanwu decoction,BYHWD)為中醫(yī)臨床使用的經(jīng)典方劑,源自《醫(yī)林改錯(cuò)》的經(jīng)典方劑,由生黃芪、當(dāng)歸、桃仁、赤芍、川芎、地龍,紅花七味藥組方而成,具有益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)之功效,其有效成分主要是芍藥苷、黃芪甲苷等[3]。BYHWD的主要藥理作用包括:改善個(gè)體微循環(huán)作用、改善血液流變學(xué)作用、抗氧化作用,抗炎作用,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫以及保護(hù)神經(jīng)作用等[4],對(duì)DPN療效顯著。DPN患者通常伴有炎癥癥狀,而BYHWD對(duì)DPN炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究采用db/db小鼠(為一種自發(fā)性2型糖尿病的小鼠模型)作為DPN炎癥反應(yīng)模型,觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)db/db小鼠TLR4/MAPK/NF-κB信號(hào)通路以及炎癥因子的影響,探討B(tài)YHWD通過TLR4/MAPK/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸對(duì)db/db小鼠周圍神經(jīng)炎癥損傷的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

同周齡同系別的7周齡SPF級(jí)雄性db/db小鼠40只,體質(zhì)量25-35 g,7周齡SPF級(jí)雄性db/m小鼠,10只,體質(zhì)量20-25 g,均購于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(粵)2017-0045。實(shí)驗(yàn)環(huán)境,室溫控制在20-25 ℃,相對(duì)濕度控制在55%-65%,自由進(jìn)食,攝水,飲用水為無菌去離子水,12 h光照晝夜循環(huán)。

1.2 藥物

補(bǔ)陽還五湯各組方藥材顆粒均購自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,包括黃芪生黃芪120.0 g、當(dāng)歸6.0 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、桃仁3.0 g、紅花3.0 g、地龍3.0 g組成。

1.3 主要試劑和儀器

兔抗TLR4多克隆抗體兔抗、兔抗p38 MAPK和p-P38 MAPK購自美國Abcam公司,兔抗IκB-α和p-IκB-α多克隆抗體兔抗、兔抗P65和p-P65多克隆抗體購自美國CST公司。IL-6、IL-1β和TNF-α細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒均購自江蘇酶免生物工程有限公司。化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司);凝膠電泳儀(美國BIORAD公司);Maroche ATOM全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(意大利Maroche公司);RB200型智能熱板儀(成都泰盟軟件有限公司)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(美國Hyclone公司);ECL超敏發(fā)光試劑盒(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)。

1.4 BYHWD的制備

補(bǔ)陽還五湯每劑的總質(zhì)量為144.0 g(即黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁藥材顆粒各1袋,與該方處方組成一致),溶解于溫水(30-40 ℃,下同)11.3 ml中,配制成質(zhì)量濃度約為12.8 g/ml(以顆粒劑總質(zhì)量計(jì))的藥液,再用溫水分別稀釋成6.4,3.2,1.6 g/ml的藥液,備用。

1.5 動(dòng)物分組及給藥

將40只db/db小鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按照空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L標(biāo)準(zhǔn),確認(rèn)小鼠為糖尿病模型,按照小鼠的FBG和體質(zhì)量數(shù)據(jù),進(jìn)行分層,隨機(jī)分組分為4組:模型和BYHWD高、中、低劑量(6.4,3.2和1.6 g/kg)組,小鼠的給藥劑量,根據(jù)小鼠與人體表面積換算法計(jì)算,另將10只db/m小鼠(為表型正常的小鼠)作為空白對(duì)照組。給藥組按體質(zhì)量每千克予10 ml相應(yīng)濃度的藥物溶液灌胃,空白對(duì)照和模型組按體質(zhì)量每千克予10 ml的去離子水灌胃給藥,每天灌胃給藥1次,持續(xù)給藥84 d。

1.6 足底熱敏反應(yīng)時(shí)長實(shí)驗(yàn)

第84天末次給藥后,開啟智能熱板儀,將熱敏板溫度設(shè)置為55 ℃,待溫度穩(wěn)定在55 ℃后,將小鼠放于熱敏板上,同時(shí)開始計(jì)時(shí),直至小鼠開始出現(xiàn)舔舐后足反應(yīng)的時(shí)間作為作為該小鼠的足底熱敏反應(yīng)時(shí)間。對(duì)每只小鼠均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,每次間隔15 min,計(jì)算3次的平均值。

1.7 血清IL-6、IL-1β和TNF-α的含量測(cè)定

第84天末次給藥后,水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血,常溫靜置1 h后,離心,分離血清,采用ELISA試劑盒(出產(chǎn)廠商)檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量,嚴(yán)格按照試劑盒中的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.8 Western blot測(cè)定測(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TLR4/MAPK/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)

根據(jù)報(bào)道的方法[5],快速取出小鼠背根神經(jīng)節(jié),稱量,根據(jù)凱基全蛋白提取試劑盒說明書,提取神經(jīng)節(jié)總蛋白,BCA定量,加入蛋白上樣緩沖液中,沸水變性,各組同一上樣量于SDS-PAGE中進(jìn)行恒流電泳,恒壓濕電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(0.22 μm);加入預(yù)先配置的封閉液(5%胎牛血清),室溫?fù)u床封閉1 h;孵育一抗:加入TLR4、p-P38、p-IκB-α、p-P65、GAPDH一抗,4 ℃冷室搖床孵育過夜。TBST洗膜,再加入對(duì)應(yīng)一抗種屬的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5 h。按照ECL發(fā)光液說明書1 ∶1配比進(jìn)行顯影;化學(xué)發(fā)光儀對(duì)條帶進(jìn)行掃描,Image J軟件分析各條帶中目的蛋白的密度值,以目的蛋白(TLR4,p-P38,p-IκB-α,p-P65蛋白)與內(nèi)參(GAPDH)的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所用數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足底熱敏反應(yīng)時(shí)間的變化

結(jié)果顯示,模型組小鼠足底熱敏反應(yīng)時(shí)間較空白對(duì)照組顯著增加(P<0.05);與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯各劑量組足底熱敏反應(yīng)時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.48,P<0.05,見表1)。在給藥組中,隨著劑量的增加,db/db小鼠熱敏反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)降低,以高劑量組db/db小鼠熱敏反應(yīng)時(shí)間減少較為顯著,約為模型組的2倍。

表1 各組小鼠足底熱敏反應(yīng)時(shí)間比較

Table 1 Comparison of plantar thermal response time of mice among five groups

組別n足底熱敏反應(yīng)時(shí)間(s)空白對(duì)照組1010.94±1.02模型組1023.53±1.62#補(bǔ)陽還五湯低劑量組1019.38±0.91#?補(bǔ)陽還五湯中劑量組1015.01±0.76#?補(bǔ)陽還五湯高劑量組1013.37±0.85?

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

2.2 小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平的變化

與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,BYHWD高、中劑量組血清中IL-1β、IL-6水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);補(bǔ)陽還五湯各劑量組血清中TNF-α水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較(n=10,ng/ml)

Table 2 Comparison of IL-6, IL-1β and TNF-α expression level in mouse serum among five groups(n=10,ng/ml)

組別IL-6 IL-1β TNF-α 空白對(duì)照組 40.76±8.5735.19±4.78153.27±20.53模型組107.24±10.02#77.58±5.74#359.06±29.69#補(bǔ)陽還五湯低劑量組 95.33±9.40#70.80±5.03#287.29±37.54#?補(bǔ)陽還五湯中劑量組 71.83±8.94#?56.92±5.84#?194.62±25.05#?補(bǔ)陽還五湯高劑量組 57.49±11.86?44.36±7.31?149.81±32.25?

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

2.3 背根神經(jīng)節(jié)TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白的表達(dá)

與空白對(duì)照組比較,模型組TLR4,p-P38,p-IκB-α和p-P65蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05);與模型組對(duì)比,補(bǔ)陽還五湯高、中劑量組中的TLR4,p-P38,p-IκB-α和p-P65蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05,見圖1),呈劑量依賴性,各實(shí)驗(yàn)組中非磷酸化p38,IκB-α和P65表達(dá)不變,不受影響。

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖1 各組小鼠背根神經(jīng)節(jié)中TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of TLR4, p38 MAPK, p-P38, IκB-α, P65, p-IκB-α, and p-P65 proteins in the dorsal root ganglia in each group

3 討論

DPN屬中醫(yī)學(xué)“氣虛”“血瘀”范疇,病位在血絡(luò),消渴先發(fā)為本,DPN繼發(fā)為標(biāo),由虛致實(shí)、虛實(shí)夾雜,其基本病機(jī)概括為氣陰兩虛,瘀血阻絡(luò)。氣虛則血行不暢,陰虛則血行澀滯,致使痰瘀互結(jié),痹阻脈絡(luò),不通則痛,故見肢體[6]。而西醫(yī)理論則認(rèn)為DPN的病理生理的基礎(chǔ)是由于神經(jīng)血管內(nèi)皮損傷,進(jìn)而導(dǎo)致大腦血液供應(yīng)不足引起的[7]。補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)為補(bǔ)陽還五湯的功效,能顯著改善病人血液循環(huán)狀態(tài),提高病人體質(zhì),對(duì)改善患者預(yù)后具有重要的作用。db/db小鼠是一種基因突變誘導(dǎo)的自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠,是對(duì)瘦素受體基因進(jìn)行突變導(dǎo)致的,是科研界用于研究2型糖尿病理想的動(dòng)物模型之一。db/db小鼠生長至8周后,小鼠的周圍神經(jīng)就開始自發(fā)性的病變,主要表現(xiàn)為髓神經(jīng)纖維缺失和髓鞘脫落[8],坐骨神經(jīng)髓鞘的厚度顯著減少[9],觸覺神經(jīng)異常性疼痛和足底熱痛覺明顯減退[10]等。

有研究報(bào)道,在db/db小鼠的脊髓背角和坐骨神經(jīng)中,炎性因子IL-1β、TNF-α等的表達(dá)水平均明顯上升[11,12],表明炎癥反應(yīng)與db/db小鼠周圍神經(jīng)病變有著緊密的聯(lián)系,炎性因素在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比于空白對(duì)照組,db/db模型小鼠的熱敏反應(yīng)時(shí)間顯著增加。相比于模型組,給藥組db/db小鼠熱敏反應(yīng)時(shí)間均顯著減少,其中以高劑量組較為顯著,約為模型組的兩倍,這提示補(bǔ)陽還五湯對(duì)db/db小鼠周圍神經(jīng)的神經(jīng)感覺功能具有較好的改善作用。在給藥組中,隨著劑量的增加,db/db小鼠熱敏反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)降低,這表明陽還五湯對(duì)db/db小鼠周圍神經(jīng)的神經(jīng)感覺功能的改善作用呈劑量依賴性。

大量研究已表明,TLR4信號(hào)通路在DPN的炎癥反應(yīng)中扮演重要的角色,其中TLR4可通過其下游MyD88依賴性以及非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)和因子。MyD88依賴性信號(hào)通路中參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子有MyD88,TRAF-6等,經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后,激活MAPK,NF-κB等信號(hào)通路,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá),誘發(fā)炎癥反應(yīng)[13-15]。通過抑制TLR4信號(hào)通路,可抑制糖尿病神經(jīng)病變的進(jìn)展[16]。為此,本研究初步探討了不同劑量補(bǔ)陽還五湯對(duì)db/db小鼠血清及背根神經(jīng)節(jié)中相關(guān)炎性因子的影響。實(shí)驗(yàn)觀察到補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后,小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α及背根神經(jīng)節(jié)TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白的表達(dá)顯著降低,表明補(bǔ)陽還五湯在一定程度上抑制了TLR4的活化,減少炎癥因子釋放,降低免疫反應(yīng)的放大程度,并進(jìn)一步緩解周圍神經(jīng)組織損傷,達(dá)到改善周圍神經(jīng)病變的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示,補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)作用具有一定的劑量依賴性,以高劑量的作用效應(yīng)最優(yōu)。

綜上所述,補(bǔ)陽還五湯對(duì)DPN小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用可能通過抑制DPN中TLR4信號(hào)通路的激活,抑制下游炎癥因子表達(dá),從而改善糖尿病周圍神經(jīng)病變,但其具體調(diào)控機(jī)制,尚需進(jìn)一步研究。