梁衛(wèi)東，曾小飛，吳鵬，周家田，顏神超

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,成都 610500

食管癌是世界上常見的高病死率惡性腫瘤之一[1]，食管鱗癌是其主要組織學(xué)亞型。由于食管鱗癌早期缺乏特異性癥狀及體征，患者確診時(shí)大多處于中晚期，其5年生存率為15%～25%[2]。相反，早期確診食管鱗癌并接受手術(shù)治療的患者5年生存率接近90%[3]。微小RNA(miRNA)是一類單鏈、保守、20～24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼小分子RNA。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)非特異性結(jié)合，抑制其翻譯或調(diào)節(jié)降解以參與腫瘤的增殖、分化、遷移和凋亡[4]。Lawrie等[5]首次在B淋巴瘤患者外周循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)miRNA穩(wěn)定表達(dá)且能在早期被檢測(cè)出，其異常表達(dá)與腫瘤的診斷及預(yù)后相關(guān)。目前，已相繼有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA用于胃癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9]及宮頸癌[10]的早期診斷，且其特異度及靈敏度均優(yōu)于傳統(tǒng)血清診斷學(xué)標(biāo)志物。已有研究證實(shí)，miR-424在子宮內(nèi)膜癌及肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用[11]，且可作為宮頸癌[12]、肝癌[13]和非小細(xì)胞肺癌[14]的診斷標(biāo)志物和預(yù)后因子。在食管鱗癌中，miR-424存在異常表達(dá)，并且可作用于下游靶位點(diǎn)，抑制腫瘤增殖[15]。在肝癌和結(jié)直腸癌患者血漿中可檢測(cè)到miR-92a異常表達(dá)，并且可作為診斷、預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[16]。在食管鱗癌中，miR-92a明顯高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展并可作為預(yù)后因子指導(dǎo)后續(xù)治療[17]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b表達(dá)均與食管鱗癌和肝癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[18]。盡管研究已證實(shí)miR-424、miR-92a及miR-130b與食管鱗癌的進(jìn)展密切相關(guān)，但miR-424、miR-92a及miR-130b能否用于食管鱗癌早期診斷尚不清楚。2017年1月～2018年5月，我們檢測(cè)了食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平，評(píng)估其在食管鱗癌中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸心外科2017年1月～2018年5月收治的食管鱗癌患者43例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未采取包括放療、化療在內(nèi)的任何治療；②術(shù)中均常規(guī)行淋巴結(jié)清掃術(shù)；③手術(shù)切除標(biāo)本送病理檢查，最終術(shù)后病理檢查結(jié)果提示為食管鱗狀細(xì)胞癌。健康體檢者43例食管鱗癌患者中，男33例、女10例，年齡40～75(59.16±1.17)歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)與國際抗癌聯(lián)盟(UICC)共同制定的食管惡性腫瘤TNM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期15例。另選取同期體檢健康者43例，男26例、女17例，年齡42～73(57.92±0.93)歲。體檢健康者均未發(fā)現(xiàn)患有高血壓、糖尿病、心臟病及其他惡性腫瘤等病史。本研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達(dá)檢測(cè) 食管鱗癌患者于入院次日采集清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，健康體檢者于體檢當(dāng)日采集空腹肘正中靜脈血5 mL，置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，室溫放置1 h，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入1.5 mL RNase-free EP管中，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清轉(zhuǎn)入1.5 mL RNase-free EP管中，置于-80 ℃深低溫冰箱中保存。根據(jù)北京TIANGEN公司提供的miRNA提取分離試劑盒進(jìn)行血漿總RNA提取，使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo Scientific)檢測(cè)RNA純度，并采用電泳技術(shù)進(jìn)行RNA定量分析。根據(jù)北京TIANGEN公司提供的miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，冰上配置反應(yīng)體系：Total RNA 5 μL，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。通過miR Base數(shù)據(jù)庫查詢獲得基因序列，由四川生工科技有限公司合成提供引物(miR-424正向引物：5′-GAUACAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAAGUGU-3′，miR-424反向引物：5′-CAGTGCGGTGTCGGTTGAGGT-3′；miR-92a正向引物：5′-GAUUGCACUAGUCCCGGCCUUC-3′，miR-92a反向引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；miR-130b正向引物：5′-GACACUCUUUCCCUGUUGCACUACU-3′，miR-130b反向引物：5′-CGCAGTGCAATGATGAAAGG-3′；U6正向引物：5′-GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT-3′，U6反向引物：5′-AACCGTTCTACCGATGTTGGT-3′)。根據(jù)北京TIANGEN公司miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，以上述合成的cDNA為模板，U6為內(nèi)參，冰上配置10 μL反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA Premix 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，miRNA第一鏈cDNA 0.5 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，ddH2O 3 μL，每項(xiàng)反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min起始模板變性；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)退火、延伸；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解曲線分析。計(jì)算不同樣品平均Ct值，以2-ΔCt法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量，ΔCt食管鱗癌=Ct食管鱗癌-Ct內(nèi)參，ΔCt對(duì)照組=Ct對(duì)照—Ct內(nèi)參，2-ΔCt為食管鱗癌或健康人目的基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者及體檢健康者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平比較 食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-424相對(duì)表達(dá)量分別為0.291 3±0.079 0、0.121 6±0.031 7，二者表達(dá)比較，P=0.001 2；食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-92a相對(duì)表達(dá)量分別為4.698 0±0.462 8、1.571 0±0.092 8，二者表達(dá)比較，P<0.000 1；食管鱗癌患者和體檢健康者血漿miR-130b相對(duì)表達(dá)量分別為3.816 0±0.417 0、1.042 0±0.084 9，二者表達(dá)比較，P<0.000 1。

2.2 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系 見表1。

表1 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b水平與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系

2.3 血漿miR-424、miR-92a及miR-130b在食管鱗癌中的診斷價(jià)值 制作的ROC曲線示，血漿miR-424用于食管鱗癌診斷對(duì)應(yīng)的AUC為0.703(95%CI:0.595～0.797)，miR-92a對(duì)應(yīng)的AUC為0.720(95%CI:0.613～0.812)，miR-130b對(duì)應(yīng)的AUC為0.862(95%CI:0.771～0.927)；而血漿miR-424用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度為72.09%和62.79%，血漿miR-92a對(duì)應(yīng)的特異度及靈敏度為51.84%和88.37%，血漿miR-130b對(duì)應(yīng)的特異度及靈敏度為90.70%和81.40%。

3 討論

臨床資料表明，對(duì)于早期食管鱗癌患者，術(shù)后5年和10年生存率明顯優(yōu)于中晚期患者。然而，由于食管鱗癌患者缺乏早期特異的癥狀及體征，加上目前檢查手段的局限性，導(dǎo)致食管鱗癌患者預(yù)后欠佳。miRNA已被證實(shí)可同時(shí)存在于惡性腫瘤組織和血漿中，參與腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程且作為新的生物學(xué)指標(biāo)指導(dǎo)后續(xù)診斷和治療[6～10]。循環(huán)miRNA較短，且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而具有耐受RNA酶的高度穩(wěn)定性，其在血漿或血清中能穩(wěn)定存在，加之其特異性和獨(dú)特的表達(dá)模式，因此可作為惡性腫瘤診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達(dá)均明顯高于健康人；血漿miR-92a、miR-130b表達(dá)均與食管鱗癌患者的腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)；而低分化患者血漿miR-130b表達(dá)較高分化患者顯著上調(diào)。

miR-424在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)明顯增高，而過表達(dá)的miR-424通過作用于TNFAIP1的3′-UTR，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-424表達(dá)越高的患者往往預(yù)后不良，生存期較miR-424低表達(dá)者明顯縮短，miR-424可作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后因子[14]。在食管鱗癌中，miR-424表達(dá)明顯上調(diào)，而將其敲除可激活PRKCD及其下游p38 MAPK和JNK信號(hào)通路，增加p21蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制食管鱗癌發(fā)生發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌患者血漿中，miR-424表達(dá)相對(duì)于健康人群明顯上調(diào)，但其與食管鱗癌腫瘤分級(jí)、分化、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度僅為72.09%和62.79%，AUC為0.703。此前，血漿miR-424已被表明在肝癌中診斷的特異度和靈敏度分別為90.29%和95.12%[13]，明顯優(yōu)于其單獨(dú)用于食管鱗癌中的診斷價(jià)值。因此，血漿miR-424有望聯(lián)合其他診斷學(xué)標(biāo)志物，提高其用于診斷食管鱗癌的特異度和靈敏度。

MiR-92a屬于miR-17-92a簇，位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)2帶至3區(qū)3帶之間(13q32-33)，其在眾多惡性腫瘤中是一個(gè)顯著擴(kuò)增的區(qū)域。miR-92a表達(dá)在肝癌組織中明顯增高，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-92a通過抑制FOXA2表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮原癌基因的作用[20]。此外，miR-92a同樣存在于結(jié)直腸癌患者血循環(huán)中，并可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[16]。Chen等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-92a在食管鱗癌組織中上調(diào)，并可通過作用于CDH1的3′-UTR，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。除此以外，miR-92a表達(dá)還可評(píng)估食管鱗癌患者的預(yù)后情況，可作為食管鱗癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。本研究證實(shí)，食管鱗癌患者血漿miR-92a表達(dá)高于健康人群，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者血漿miR-92a表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯增高，且TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鱗癌患者的血漿miR-92a表達(dá)明顯高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者，miR-92a用于診斷食管鱗癌的特異度及靈敏度分別為51.84%和88.37%，AUC為0.720，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的生物學(xué)標(biāo)志物SCC-Ag(AUC=0.665)和CEA(AUC=0.549)[22]。此前，也尚未見血漿miR-92a單獨(dú)用于評(píng)價(jià)食管鱗癌診斷價(jià)值的相關(guān)報(bào)道，因此，血漿miR-92a有望作為早期篩查食管鱗癌的新的生物學(xué)標(biāo)志物。但可能存在樣本量不足、檢測(cè)試劑及個(gè)體差異等問題，血漿miR-92a單獨(dú)用于食管鱗癌診斷的特異度尚未令人滿意。結(jié)合目前已有研究經(jīng)驗(yàn)，血漿miRNA聯(lián)合檢測(cè)可增加結(jié)直腸癌[24]、宮頸癌[25]診斷的特異度和靈敏度，彌補(bǔ)單個(gè)血漿miRNA所存在的局限性。因此，血漿miR-92a可結(jié)合其他血漿miRNA，提高其用于食管鱗癌的診斷價(jià)值。

本研究還檢測(cè)到血漿miR-130b表達(dá)在食管鱗癌患者中明顯上調(diào)，且與臨床病理特征間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中T4食管鱗癌患者血漿miR-130b表達(dá)均比T1、T2和T3患者增高，T3食管鱗癌患者血漿miR-130b表達(dá)與T1間同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者血漿miR-130b表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者增高；與此同時(shí)，低分化患者血漿miR-130b表達(dá)較高分化患者上調(diào)；TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鱗癌患者血漿miR-130b表達(dá)高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者。血漿miR-130b診斷食管鱗癌所對(duì)應(yīng)的AUC為0.862，特異度及靈敏度分別為90.70%和81.40%，相較于上述兩種指標(biāo)，血漿miR-130b用于食管鱗癌診斷的特異度和靈敏度更高。已有研究證實(shí)，miR-130b通過結(jié)合PTEN mRNA的3′-UTR以降低PTEN蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)Akt磷酸化，最終導(dǎo)致食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。因此，血漿miR-130b在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并有望作為食管鱗癌診斷新的生物學(xué)標(biāo)志物。

此次研究尚存在局限性。首先，研究樣本量相對(duì)較小；其次，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b用于食管鱗癌診斷的特異度和靈敏度尚未令人十分滿意，若早期將血漿miRNA進(jìn)行大范圍篩選并將常規(guī)生物標(biāo)志物或其他miRNA組合可能更好。最后，未獲得足夠的數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，因此，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b的預(yù)后價(jià)值未知，在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪調(diào)查，以評(píng)估其在食管鱗癌中的預(yù)后意義。

綜上所述，食管鱗癌患者血漿miR-424、miR-92a及miR-130b表達(dá)均明顯高于健康人，血漿miR-424、miR-92a及miR-130b可作為食管鱗癌診斷的新的生物學(xué)標(biāo)志物。血漿miR-92a、130b異常表達(dá)可能與食管鱗癌進(jìn)展密切相關(guān)。