中華鱉白細(xì)胞介素17原核表達及多克隆抗體制備

梁真真，徐海圣

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

中華鱉(Pelodiscussinensis)俗稱甲魚，是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，集約化程度不斷提高，傳染性疾病暴發(fā)對中華鱉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅并制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前主要采用化學(xué)藥物防治疾病，而化學(xué)藥物的不規(guī)范使用會帶來較大的食品安全隱患，并危害生態(tài)環(huán)境。免疫防治作為一種更加安全環(huán)保的防控手段，逐漸成為研究熱點[2]。白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL17)是一種促炎細(xì)胞因子，由6種IL-17家族配體和5種受體組成[3]。IL17主要由Th17細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞的增殖分化、生物因子的轉(zhuǎn)錄與表達、機體的免疫調(diào)節(jié)及腫瘤生長等，可誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、趨化因子及抗菌蛋白的產(chǎn)生，在機體的宿主防御中發(fā)揮重要作用，與多種自身免疫疾病和炎癥疾病密切相關(guān)[4-5]。IL17在腫瘤研究中得到廣泛關(guān)注，在前列腺癌[6]、乳腺癌[7]和胃癌[8]等多種人類腫瘤中均已檢測到Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL17的表達。本研究構(gòu)建了IL17原核表達載體pET28a-IL17，成功進行了融合蛋白的體外表達并制備多克隆抗體，為探討IL17在中華鱉免疫調(diào)節(jié)中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21(DE3)、原核表達載體pET28a，均購自浙江易思得生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，Sigma公司；Ni-NTA柱， Invitrogen公司；NC膜，密理博(中國)有限公司；酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；預(yù)染低分子量蛋白Marker，BIO-RAD公司；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，Abcam公司；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒，浙江易思得生物科技有限公司。

1.1.3 實驗動物

健康新西蘭大白兔，體重2.5 kg，由浙江大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白表達載體的構(gòu)建

通過NCBI查到中華鱉IL17基因序列的GenBank號為XM_006137045.2，將IL17蛋白基因序列進行大腸埃希菌密碼子偏好性優(yōu)化，并在其5′端和3′端分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，優(yōu)化設(shè)計完成后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因合成，合成的片段克隆至pET28a載體，即pET28a-IL17載體。將陽性質(zhì)粒pET28a-IL17送至杭州尚亞公司進行測序，并保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-IL17轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于1 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)菌液至渾濁時，再擴大培養(yǎng)，待D值等于0.6時加1 mmol·L-1誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)，最終培養(yǎng)時間為3 h，每隔1 h 取樣10 μL，進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.3 重組蛋白的純化

在菌液沉淀中加入5 mL PBS緩沖液重懸，并加入0.1 mmol·mL-1蛋白酶抑制劑PMSF，冰浴條件下超聲破碎，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用8 mol·L-1尿素緩沖液溶解沉淀后，12 000 r·min-1離心10 min，留上清，按照 Ni-NTA柱操作手冊進行蛋白純化，用SDS-PAGE蛋白膠檢測蛋白的純化情況。

1.2.4 多克隆抗體制備

取重組IL17蛋白1 mg，與等體積佐劑充分混合，每隔2周采用皮下注射的方式對2只新西蘭大白兔進行免疫，共免疫4次。第1次免疫時使用完全弗氏佐劑，其他3次使用不完全弗氏佐劑。第4次免疫2周后，心臟采血，5 000 r·min-1離心20 min后取上清，使用Protein A/G進行血清的純化。

1.2.5 Western blot分析

將純化好的IL17蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離，將蛋白條帶轉(zhuǎn)至NC膜上，用1% BSA溶液4 ℃過夜封閉，加入1%BSA 1∶5 000稀釋的IL17蛋白多克隆抗體，室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗(1% BSA 1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌3次，顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定

將合成的重組表達質(zhì)粒pET28a-IL17進行測序，測序結(jié)果與密碼子優(yōu)化后的序列比對一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，優(yōu)化前后的序列相似性為74.6%(圖1)。

圖1 IL17基因序列優(yōu)化前后比對

2.2 體外表達產(chǎn)物的鑒定

如圖2所示，誘導(dǎo)表達1、2、3 h后，在約20 ku處有1條與預(yù)期大小相符的特異蛋白帶，說明IL17蛋白在BL21(DE3)表達菌中成功表達。

2.3 純化產(chǎn)物的鑒定

通過Ni-NTA柱對樣品進行親和層析純化，可獲得純度較高的重組IL17蛋白(圖3)。

2.4 IL17多克隆抗體檢測

用純化蛋白免疫新西蘭白兔后，取血清，對抗體進行純化后，用抗體稀釋液與過表達IL17蛋白進行Western blot分析。結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體與純化蛋白可發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。

1—蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2—誘導(dǎo)前；3—誘導(dǎo)后1 h；4—誘導(dǎo)后2 h；5—誘導(dǎo)后3 h。圖2 重組IL17蛋白的SDS-PAGE鑒定

1—過柱后流穿液；2—6第1次到第5次洗脫樣品；7—蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。圖3 親和純化IL17蛋白樣品的SDS-PAGE鑒定

圖4 IL17多克隆抗體對IL17蛋白的 Western blot鑒定

3 討論

本研究成功構(gòu)建了pET-28a-IL17重組表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達菌進行IL17蛋白的體外誘導(dǎo)表達，表達的目的蛋白大小與預(yù)期相符，表明優(yōu)化后的表達載體能夠成功表達目的蛋白。雖然中華鱉的IL17蛋白序列已經(jīng)存在，但是國內(nèi)外并未有報道中華鱉IL17蛋白的生物學(xué)特性及免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗利用體外表達技術(shù)，制備了中華鱉IL17蛋白的抗體，對IL17蛋白的作用研究有重要意義。

IL17的研究已經(jīng)向應(yīng)用研究的方向發(fā)展。白介素-17(IL17)是由Th17細(xì)胞分泌的參與中性粒細(xì)胞增殖、成熟和趨化、增強局部炎癥反應(yīng)的炎性因子，與其受體結(jié)合后可誘導(dǎo)白介素-6、腫瘤壞死因子TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β等促炎癥因子的表達，造成局部炎癥，在肝癌、直腸癌及卵巢癌等多種腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。Punt等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IL17主要在中性粒細(xì)胞中表達，能促進腫瘤生長。Carvalho等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IL17高表達的甲狀腺癌患者其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高。對于中華鱉來說，免疫防病及其機理方面的研究才剛起步，全面了解中華鱉IL17蛋白的生物學(xué)功能及其在免疫反應(yīng)中的特點，并作為免疫增強劑在抵抗疾病中的應(yīng)用研究具有重意義。