陳 雅 ，袁德義 *，李 葵 ，楊穎慧 ，金亦佳 ，林銘浩 ，鄒 鋒

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙410004；3.湖南省懷化市林業(yè)科學研究所，湖南 懷化 418000）

【研究意義】油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶科（Theacea）山茶屬（Camellia）植物，是我國木本油料樹種中的主栽物種之一，分布于南方18個?。ㄊ?、自治區(qū)）700多個縣（市）[1]。茶油作為高級食用油，被譽為“東方橄欖油”[2]，長期食用茶油對心腦血管疾病具有良好的保健作用。“三華系列”是普通油茶大果高產(chǎn)新品種，分別為‘華碩’（C.oleifera‘Huashuo’）[3]、‘華鑫’（C.oleifera‘Huaxin’）[4]和‘華金’（C.oleifera‘Huajin’）[5]。油茶是自交不親和和異花授粉的木本油料樹種，為進一步充分利用“三華系列”優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源及開展相關的雜交育種研究，如科學品種配置栽培和油茶的花粉直感效應研究等，開展“三華系列”系列雜交在充分利用優(yōu)質(zhì)資源上顯得尤為重要。而花粉是種質(zhì)傳遞遺傳信息的重要形式之一，是種質(zhì)資源保存及雜交育種的重要材料[6]。在油茶雜交育種工作時若遇花期不遇、花粉污染等問題，這給雜交育種等工作帶來諸多不便。這些問題也恰好說明開展“三華系列”花粉活力測定及其保存等研究具有重要意義。【前人研究進展】用于檢測花粉活力的方法有很多，主要包括離體萌發(fā)法、I2-KI法、FDA熒光染色法、氯化三苯基四氮唑染色法（TTC法）和稀硝酸測定法等[7-8]。其中，I2-KI法是通過花粉內(nèi)的淀粉含量來指示花粉活力，以此反映花粉的代謝及營養(yǎng)情況[9]；FDA熒光染色法能測試花粉中酶活性及質(zhì)膜的完整性[10]。花粉的離體萌發(fā)法是研究花粉生物學的一種非常方便和有效的技術[11-12]，是測定花粉活力最直觀可靠的方法。花粉萌發(fā)能力是檢測花粉生活力的指標之一[13]，通常以花粉萌發(fā)率來表示。袁德義等[14]以攸縣油茶等7種材料進行試驗，發(fā)現(xiàn)離體萌發(fā)法能夠準確測定油茶花粉生活力?！颈狙芯壳腥朦c】目前，用染色法來跟蹤和快速測定油茶花粉活力少有報道，而染色法快速便捷，是開展授粉前快速測定花粉活力的首選方法，因此開展親本花粉活力測定，選擇適宜的花粉活力檢測方法顯得尤為重要?！緮M解決的關鍵問題】本研究以油茶“三華系列”為試材，采用離體萌發(fā)法、I2-KI法和FDA熒光染色法觀測其在不同貯藏條件（溫度）下的花粉活力情況，以期篩選出最適宜的花粉活力檢測方法，旨在為油茶花粉貯藏以及雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油茶栽培品種“三華系列”（‘華碩’、‘華金’、和‘華鑫’）栽種于湖南省長沙市中南林業(yè)科技大學油茶科研基地。在盛花期花蕾尚未展開時，選擇健康的15年生油茶植株，收集花枝，帶回中南林業(yè)科技大學經(jīng)濟林重點實驗室。在花枝上取發(fā)育良好的花蕾進行水培?；ɡ匍_放時，用鑷子取出花藥，放在硫酸紙中，在80 W燈泡下放置3～4 h[15]，保持溫度在28～30℃，使花藥開裂并散粉。收集花粉分成兩部分，一部分花粉用于當天的活力測試，另一部分分裝在含有不同硅膠干燥劑的10 mL的離心管中，用于不同溫度條件下貯藏的花粉活力測試。

1.2 試驗方法

采用離體萌發(fā)法[16]，F(xiàn)DA熒光染色法[17]和I2-KI法[18]測定油茶“三華系列”的新鮮花粉活力?！叭A系列”的每種貯藏花粉各分成4份，每份6瓶，共24瓶，分別置于室溫（Room temperature，RT）、冰箱冷藏室（4℃）、冰箱冷凍室（-30℃，-80℃）中。達到設定貯藏時間（1周、5周、9周、13周、17周和26周）時，從4種溫度中取出“三華系列”花粉并利用離體萌發(fā)法[14]和FDA熒光染色法[10]來測定其花粉活力。對于放置在-30℃和-80℃貯藏溫度下的花粉，需取出后逐步解凍，放入4℃下過渡1 h后再測定活力[19]。每個處理重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

“三華系列”油茶花粉活力以平均值±標準差表示。利用SPSS軟件19.0進行單因素方差分析（Oneway ANOVA）和T檢驗（P＜0.05，P＜0.01）。

2 結果與分析

常溫條件下，‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’花粉活力在不同的測定方法中具有明顯差異（表1）。采用I2-KI染色法測定“三華系列”新鮮花粉活力，花粉粒全被染成黃褐色（圖1A），花粉無活力。用FDA熒光染色法和離體萌發(fā)法測定‘華鑫’、‘華碩’及‘華金’新鮮花粉活力，結果存在顯著差異（P＜0.05）。采用FDA熒光染色法有活力的花粉發(fā)出黃綠色熒光，無熒光的花粉表示無活力（圖1B）。用離體萌發(fā)法和FDA熒光染色法的檢測結果表明3個品種的花粉活力具有顯著差異，‘華鑫’花粉活力最高，分別為86.54%和93.02%；‘華碩’花粉活力較低，分別為77.96%和85.18%；而‘華金’花粉活力最低，分別為47.57%和74.81%，說明這2種方法檢測結果存在顯著差異。2種檢測方法得出的花粉活力結果有顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)DA熒光染色法檢測的結果顯著大于離體萌發(fā)法的檢測結果（表2，圖2）。

表1 3種測定方法測定的新鮮花粉活力比較Tab.1 Comparison of the vitality of fresh pollen measured by 3 methods of investigation

圖1 不同花粉活力測定方法的檢測Fig.1 Detection of different test methods in pollen viability

圖2 兩種方法檢測貯藏的“三華系列”油茶花粉活力情況Fig.2 Comparison of two staining methods for pollen viability of Camellia oleifera under different four temperatrue

在不同貯藏時間下，‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’適宜的貯藏溫度大體呈現(xiàn)出一致的規(guī)律，基本無顯著差異。短期貯藏（5周）下，“三華系列”花粉適宜于在4℃低溫貯藏，花粉活力40%～70%，花粉活力顯著高于其他貯藏溫度的花粉；長期貯藏（26周）下，-80℃貯藏條件下貯藏效果優(yōu)于-30℃，在26周時花粉萌發(fā)率近似為-30℃的2倍，花粉活力30%～40%。

室溫貯藏下，隨著時間的推移，花粉活力下降速度逐步加快（圖2，表2）。室溫貯藏1周后，離體萌發(fā)法顯示‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’分別下降了27.86%和10.79%和8.92%，而FDA熒光染色法分別下降了23.28%、13.63%和3.01%；貯藏5周后，離體萌發(fā)法檢測‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’花粉萌發(fā)率下降幅度大約都在13%左右，F(xiàn)DA熒光染色法則分別下降了20.46%、8.3%和15.31%，表2還可以看出‘華碩’前9周花粉活力較其它兩種花粉下降相對較快。貯藏9周后，‘華碩’花粉活力下降了19.73%（離體萌發(fā)法）和21.59%（FDA熒光染色法）；‘華金’花粉活力下降了30.51%（離體萌發(fā)法）和41.24%（FDA熒光染色法）；‘華鑫’花粉活力下降了47.16%（離體萌發(fā)法）和42.93%（FDA熒光染色法），說明在貯藏9周后‘華金’和‘華鑫’的花粉活力較‘華碩’下降得快。貯藏至13周，油茶“三華系列”花粉皆失去活力。

表2 比較FDA熒光染色法與離體培養(yǎng)法在不同貯藏溫度及貯藏時間下油茶“三華系列”花粉活力情況Tab.2 Comparison of FDA test and in vitro germination under different storage temperature and storage time the pollen viability of three Camellia cultivars

在4℃冷藏條件下，經(jīng)FDA熒光染色法和離體萌發(fā)法檢測發(fā)現(xiàn)在“三華系列”中花粉活力隨著貯藏時間延長而明顯下降（P＜0.05），且貯藏時間與室溫貯藏相比“三華系列”明顯延長（圖2，表2）。貯藏1周后，‘華碩’花粉活力下降了2.24%（離體萌發(fā)法）和0.98%（FDA熒光染色法）；‘華金’花粉活力增加了4.54%（離體萌發(fā)法）和2.30%（FDA熒光染色法）；‘華鑫’花粉貯藏1周后活力下降了3.61%（離體萌發(fā)法），而經(jīng)FDA熒光染色法檢測后發(fā)現(xiàn)其活力沒有下降的趨勢，增加了0.39%。同時發(fā)現(xiàn)，‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’花粉活力在-30℃和-80℃儲藏條件下顯著高于5周前的花粉活力（P＜0.05）（圖2，表2）?！A金’花粉貯藏至13周時，花粉活力分別為10.95%（離體萌發(fā)法）和25.32%（FDA熒光染色法），過了4周后，花粉活力為0（離體萌發(fā)法）和8.65%（FDA熒光染色法）。花粉貯藏至26周時，‘華鑫’花粉和‘華碩’花粉均喪失活力，但‘華碩’花粉喪失活力的趨勢較‘華鑫’緩慢。

在-30℃儲藏條件下，采用FDA熒光染色法和離體萌發(fā)法測定發(fā)現(xiàn)‘華碩’、‘華金’和‘華鑫’在5周后花粉活力顯著高于4℃冷藏條件下的花粉（P＜0.05）（圖2，表2）。貯藏1周后，與新鮮花粉相比，‘華金’花粉生活力有短期內(nèi)升高的趨勢，花粉活力增加了6.3%（離體萌發(fā)法）和0.77%（FDA熒光染色法）?！A碩’和‘華鑫’花粉無此現(xiàn)象。貯藏至26周，‘華碩’，‘華金’的花粉活力分別保持在17%左右（離體萌發(fā)法）和22%左右（離體萌發(fā)法）；‘華鑫’的花粉活力維持在36.42%（離體萌發(fā)法）和44.08%（FDA熒光染色法）。

在-80℃儲藏條件下，與其他貯藏溫度條件比較，“三華系列”的花粉活力下降幅度最小，總體呈緩慢下降的趨勢（圖2，表2）。貯藏1周后，與新鮮花粉相比，“三華系列”花粉生活力皆有短期內(nèi)升高的趨勢；貯藏至5周后，‘華碩’花粉經(jīng)離體培養(yǎng)法和FDA熒光染色法檢測發(fā)現(xiàn)花粉活力值有顯著差別，離體培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)‘華碩’花粉在貯藏5周后，其花粉活力顯著下降，而FDA熒光染色法測定的結果與第一周沒有顯著區(qū)別，而‘華金’與‘華鑫’花粉在貯藏5周后，兩種不同染色方法發(fā)現(xiàn)其活力顯著下降；花粉貯藏至26周后，‘華鑫’花粉活力為50.18%（離體萌發(fā)法）和64.16%（FDA熒光法）；‘華碩’花粉活力為34.86%（離體萌發(fā)法）和44.06%（FDA熒光染色法）；‘華金’花粉活力為26.94%（離體萌發(fā)法）和27.64%（FDA熒光染色法）。

通過對FDA熒光染色法與離體培養(yǎng)法2種花粉活力檢測方法進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)FDA熒光染色法在4種不同貯藏溫度下的測定結果與離體培養(yǎng)法表現(xiàn)為極顯著強相關，相關系數(shù)大于0.9（表3），這表明FDA熒光染色法可跟蹤測定“三華系列”花粉活力，是開展授粉工作前快速檢測花粉活力的好方法。

表3 4種貯藏溫度下3個油茶品種的FDA熒光染色法與離體萌發(fā)法的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of FDA test and in vitro germination of three Camellia cultivars under 4 storage temperature

3 結論與討論

本研究中，通過比較油茶的“三華系列”花粉在不同貯藏溫度下活力，可看出“三華系列”不同品種在貯藏時間上存在較大差異，‘華鑫’花粉的耐貯性高于‘華金’和‘華碩’。這表明花粉生活力的高低主要取決于種（品種）自身的遺傳特性[8]。因此，在雜交育種中，尤其是隔年的雜交育種計劃中，應該選擇‘華鑫’作為父本，這在一定程度上能提高油茶雜交育種中的授粉成功率，是獲得雜交后代及創(chuàng)新種質(zhì)的基礎。

影響花粉壽命的因素，除受遺傳因素外，環(huán)境因素對花粉貯藏的效果也會產(chǎn)生影響。明確貯藏花粉的環(huán)境因素對其活力的影響是利用貯藏花粉進行雜交育種試驗的前提[20]。其中，溫度是影響花粉活力的主要因素[21]。本研究中，貯藏溫度影響花粉活力下降的速度。在4種不同貯藏溫度下，花粉活力隨貯藏時間的延長而下降。室溫條件下花粉活力下降得最快，貯藏時間最短。據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，在室溫條件下，油茶花粉壽命的長度一般不超過2周[22-23]。而本研究中采用80 W燈泡下使花粉散粉這一花粉收集和處理方式，使其在室溫貯藏下13周后花粉才喪失活力。說明相較于在硅膠干燥器中干燥油茶花粉散粉，采用80 W燈泡下使花藥散粉有利于保持其活力。同時本研究發(fā)現(xiàn)4℃低溫冷藏條件下適合油茶“三華系列”花粉的短期貯藏，5周前花粉活力高于-30℃和-80℃貯藏溫度下的花粉，可能是由于一些花粉粒在這兩種低溫條件下細胞組織結構易結冰造成損傷，從而導致其花粉活力下降。-80℃低溫冷凍貯藏適宜于油茶花粉的長期貯藏，與張鵬等[24]和李廣清等[25]的研究結果一致，低溫有利于油茶花粉長期貯藏可用于隔年育種。本研究中也同樣發(fā)現(xiàn)“三華系列”中‘華金’在4℃、-30℃和-80℃貯藏條件下和‘華碩’在-80℃貯藏條件下出現(xiàn)花粉活力短期升高的現(xiàn)象[26]，這可能是‘華金’和‘華碩’花粉可能存在生理后熟現(xiàn)象，在矮牡丹[27]、厚莢相思[28]等植物均發(fā)現(xiàn)過這種現(xiàn)象，這可能是剛剛采集回來的新鮮花粉沒有完全生理成熟，低溫貯藏花粉可進一步實現(xiàn)油茶花粉的生理成熟，這有待進一步深入研究。

不同植物花粉內(nèi)含物成分不同，適用的染色劑可能不相同。I2-KI法是通過花粉內(nèi)的淀粉含量來指示花粉活力[9]，可在一定程度上反映花粉的代謝及營養(yǎng)情況。據(jù)前人報道，魏冬梅等[29]觀察到油茶花粉成熟時，花藥內(nèi)積累了大量的脂滴和少量的淀粉多糖內(nèi)含物，說明油茶屬于脂質(zhì)型花粉而不屬于淀粉型花粉，此研究結果能在一定程度解析本研究觀察到的現(xiàn)象，即采用I2-KI染液將“三華系列”花粉粒皆染成黃褐色。這說明I2-KI染色效果較差，不適宜作為油茶花粉活力檢測方法。而這與趙鴻杰等[18]對張氏紅山茶、越南抱莖和南山茶研究相悖，這有待進一步驗證。與此同時，離體萌發(fā)法和FDA熒光染色法檢測的花粉活力結果有顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)DA熒光染色法檢測的花粉活力顯著高于離體萌發(fā)法檢測的花粉活力，這說明FDA熒光染色方法在測定油茶花粉活力時可能存在高估的情況，與Shivanna等[10]研究8個屬（黑麥屬、鳶尾屬、苔屬、荸薺屬、毛地黃屬等等）和周堅等[17]研究鵝掌楸屬的結論一致。經(jīng)相關性分析發(fā)現(xiàn)，這2種檢測方法存在極顯著強相關關系，F(xiàn)DA熒光染色法可作為跟蹤和快速測定油茶花粉生活力變化的方法，該方法可能表征油茶花粉潛在的活力。

花粉的合理貯藏和花粉活力的鑒定可以保證人工授粉雜交育種中獲得大量的雜交后代，這在一定程度可以提高雜交育種的成功率和質(zhì)量[30]。因此，建議當采用貯藏花粉進行人工控制授粉時，應根據(jù)所檢測的花粉活力情況來開展授粉工作。本研究中無論是新鮮花粉還是貯藏花粉，F(xiàn)DA熒光染色法均可作為跟蹤和測定油茶花粉活力變化的方法來表征油茶花粉潛在活力，是開展授粉工作前快速檢測花粉活力的好方法。-80℃是油茶最適合的長期（26周）貯藏花粉溫度，4℃貯藏下是花粉短期（5周）保存最適宜的條件。其中，貯藏的花粉對雜種子代的后期生長狀況的影響還有待進一步研究。