武 江，楊 陽，楊 冉，郭愛華，張 超

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

耬斗菜（Aquilegia vulgaris L.）為毛茛科耬斗菜屬多年生草本宿根植物，耐寒，根肥大，圓柱形，外皮黑褐色，有少數(shù)分枝，原產(chǎn)于歐洲和北美洲[1]。我國有豐富而珍貴的耬斗菜野生資源，分布于青海東部、甘肅、寧夏、陜西、山東、河北、山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地[2]。耬斗菜具有較高的觀賞價(jià)值，此外其嫩莖、葉營養(yǎng)豐富可食用，根含糖，可制作飴糖或釀酒，全草或根可做婦科用藥，有免疫活性、抗腫瘤活性、肝保護(hù)作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。近年來，隨著對植物多糖研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)多糖對腫瘤、肝炎、心血管病等疾病的預(yù)防和治療[4]，以及調(diào)節(jié)糖代謝和抗衰老等方面具有獨(dú)特的生物活性[5]。因其毒副作用小、安全性強(qiáng)、功能多等特點(diǎn)而被越來越多的人關(guān)注，相關(guān)的研究也日益受到重視[6]。對華北耬斗菜的化學(xué)成分分離后鑒定出13 種化合物[7]。另有研究表明，耬斗菜提取物對黑腹果蠅具有抗衰老作用[8]。在植物多糖的提取方法中，多采用熱提法[9]、回流法和超聲波法[10]，回流波法與超聲波法曾應(yīng)用在提取蒙藥耬斗菜多糖中，但是目前采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化耬斗菜多糖的最佳提取工藝還鮮有報(bào)道。

本研究以大花耬斗菜為試材驗(yàn)料，通過微波方法提取根系多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 對耬斗菜多糖的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法（RSM）分析優(yōu)化，考察關(guān)鍵工藝參數(shù)對耬斗菜根系多糖提取率的影響，旨在為進(jìn)一步探究耬斗菜多糖的生物學(xué)活性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大花耬斗菜（Aquilegia glandulosa Fisch.ex Link.），2019 年6 月定植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。

1.2 試劑與儀器

丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醚、無水乙醇，均為分析純。

可見分光光度計(jì)VIS-723N（北京瑞利分析儀器有限公司）、萬能破碎機(jī)FW80（天津泰斯特儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9146MBE（上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、冷藏冷凍冰箱BCD-252KSA（青島海爾股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 耬斗菜根系粗多糖的提取 挖取大花耬斗菜根系，烘干并研磨成粉末，過0.177 mm 篩。準(zhǔn)確稱取耬斗菜根系粉末0.2 g，倒入燒杯中，按照一定的料液比與蒸餾水混合，后置于微波爐中進(jìn)行輔助提取。將輔助提取后的提取液于80 ℃熱水浸提1 h，離心20 min（3 500 r/min），取上清液，加入3 倍體積的無水乙醇，在4 ℃冰箱中放置過夜，后離心20 min（3 500 r/min）得沉淀，再依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚清洗，通風(fēng)干燥，得粗多糖。

1.3.2 耬斗菜根系多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測量粗多糖含量[11-15]，并于490 nm 的波長處測定吸光值?；貧w方程為：a＝1.186x-0.007 8（R2＝0.994），其中，x 為490 nm 的吸光值，a 為還原糖質(zhì)量濃度（mg/mL）。

式中，a 為回歸方程計(jì)算所得多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；b 為稀釋倍數(shù)；c 為耬斗菜根系多糖相對于葡萄糖的換算因子1.272；M 為耬斗菜粉末質(zhì)量。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 在1.3.2 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用微波輔助提取法，設(shè)置不同的微波時(shí)間（20、30、40、50、60 s）、微波功率（20、40、60、80、100 W）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）），進(jìn)行單因素試驗(yàn)，檢測所得到的耬斗菜根系多糖粗提液中多糖含量，并計(jì)算粗多糖提取率。

1.3.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 使用Design Expert 8.0.6 軟件中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微波時(shí)間（X1）、微波功率（X2）、料液比（X3）為自變量，以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面法分析試驗(yàn)。將各因素以1、0、-1 編碼，其中，0 為最佳條件，-1 為較低水平，1 為較高水平（表1）。通過對試驗(yàn)結(jié)果的回歸方差分析，優(yōu)化耬斗菜根系多糖的提取工藝條件。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 微波工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 微波時(shí)間對耬斗菜根系多糖提取率的影響由圖1 可知，在微波功率60 W、料液比1∶20（g/mL）的條件下，耬斗菜根系多糖提取率隨著微波時(shí)間的延長緩慢增大，當(dāng)微波時(shí)間超過50 s 后，多糖提取率呈快速下降趨勢。這是因?yàn)殡S著微波時(shí)間的增加，提取溫度升高，多糖降解率也增加，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，考慮50 s 為微波法中耬斗菜根系多糖提取的適宜微波時(shí)間。

2.1.2 微波功率對耬斗菜根系多糖提取率的影響由圖2 可知，在微波時(shí)間30 s、料液比1∶20（g/mL）條件下，隨著微波功率的增加，耬斗菜根系多糖提取率增加，微波功率為40 W 時(shí)，耬斗菜根系多糖提取率達(dá)到最大，繼續(xù)提高微波功率，則多糖提取率下降。這可能是因?yàn)槲⒉üβ试龃笤斐商崛∫簻囟壬?，部分多糖分解造成提取率降低?/p>

2.1.3 料液比對耬斗菜根系多糖提取率的影響 由圖3 可知，在微波時(shí)間30 s、微波功率60 W 的條件下，隨著料液比的增加，多糖提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，耬斗菜根系多糖提取率達(dá)到最大。但若繼續(xù)增大料液比，多糖溶出量反而降低。這是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到一定比值時(shí)，根系中的多糖基本全部溶出，擴(kuò)散達(dá)平衡，繼續(xù)增大溶劑量也不會促進(jìn)多糖的提取，反而會加重后續(xù)濃縮負(fù)擔(dān)[16]。

2.2 微波法多糖提取工藝的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對耬斗菜根系多糖提取條件進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。

表2 微波法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以耬斗菜根系多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，得到提取率對微波時(shí)間（X1）、微波功率（X2）、料液比（X3）的回歸方程為Y＝-32.434 726＋7.716 296X1＋3.139 657X2-0.019 000X3-0.058 190X1X2＋5.890 070X1X3＋0.001 008X2X3-0.001 488X12-0.025 040X22＋0.002 029X32。對模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表3 可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.110 6），實(shí)際試驗(yàn)值與預(yù)測具有高度相關(guān)性。表明模型與試驗(yàn)值擬合良好，試驗(yàn)方法可信度高，該模型可以對耬斗菜根系多糖的提取率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測和分析。從表3 還可以看出，微波時(shí)間、料液比對耬斗菜根系多糖提取率有極顯著影響，微波功率對耬斗菜根系多糖提取率的影響不顯著。

表3 微波法回歸模型

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析 依據(jù)回歸方程，可以獲得耬斗菜根系多糖提取的微波時(shí)間、微波功率和料液比兩兩因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線，如圖4、5、6 所示。

從圖4、5、6 可以看出，任何2 個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，微波時(shí)間和微波功率的交互作用、微波時(shí)間和料液比的交互作用以及料液比和微波功率的交互作用對多糖提取率的影響均為顯著（等高線為橢圓形）。同一料液比水平下，隨微波時(shí)間和微波功率的增加，多糖提取率逐漸增加，到達(dá)最高點(diǎn)后下降。即多糖得率在合適的微波時(shí)間和微波功率下具有極大值，該極大值存在于響應(yīng)面的頂部，也就是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)[17]。同理可得，微波時(shí)間和料液比、微波功率和料液比這2 對交互因素之間也具有極大值。通過軟件分析得到，提取耬斗菜根系多糖的最優(yōu)條件為：提取時(shí)間44.57 s、提取功率56.47 W、料液比1∶20.82（g/mL）。

2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，根據(jù)試驗(yàn)條件調(diào)整的最佳提取條件為：提取時(shí)間44 s、提取功率60 W、料液比1∶21（g/mL）。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證和重復(fù)性考察，得到真實(shí)最佳得率為17.64%，與理論得率18.21%僅相差0.57 百分點(diǎn)。進(jìn)一步表明，所得模型可以較好地預(yù)測耬斗菜根系多糖的提取情況。

3 結(jié)論與討論

本研究選擇微波時(shí)間、微波功率和料液比3 個對耬斗菜根系多糖提取率影響較大的因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)，建立相應(yīng)的二次回歸方程。通過方差分析和響應(yīng)曲面分析發(fā)現(xiàn)，微波時(shí)間和料液比為耬斗菜根系多糖提取過程中的顯著因素，并且它們的二次項(xiàng)對多糖提取率的響應(yīng)面曲線有非常顯著的影響。同時(shí)，料液比分別與微波時(shí)間、微波功率之間的交互作用顯著。

利用響應(yīng)面法得到耬斗菜根系多糖的微波法提取過程優(yōu)化的工藝條件為：提取時(shí)間44 s、提取功率60 W、料液比1∶21（g/mL）；在此條件下，多糖提取率為17.64%，與理論值接近，模型方程高度顯著，擬合度良好，可以較好地預(yù)測耬斗菜多糖的提取得率。

目前，植物藥物中粗多糖的制備主要用常規(guī)的水提醇沉法[17]。本研究對大花耬斗菜多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過響應(yīng)曲面優(yōu)化微波法中各提取條件，得到了較為理想的大花耬斗菜根系多糖的提取工藝，為進(jìn)一步研究耬斗菜屬其他植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。