基于響應面法的連翹果實總黃酮閃式提取工藝優(yōu)化

邱相坡，梁 璇，王文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

連翹（Forsythia suspense）是木犀科（Oleaceae）連翹屬（Forsythia）落葉灌木，適宜生長在灌木叢、林下、草叢或山谷疏林中[1]。連翹在我國分布較廣，除華南地區(qū)外其他各地都有栽培，多分布在山東、山西、陜西、河南、四川等地[2]。連翹果實多呈長卵形、卵形等，表面具不規(guī)則縱皺紋和凸起的斑點，頂端銳尖[3]。青翹是連翹的一種，果實剛成熟且尚帶綠色時采收得到，采收期一般在10 月下旬，其表面呈綠褐色，氣微香，味苦[4]。

連翹具有清熱解毒、疏散風熱、消腫散結的作用[5]，可用于外感風熱、溫病發(fā)熱、瘡瘍腫痛等癥狀，它具有良好的藥理作用，如抗炎、抗病原微生物、解熱、利尿等[6-9]。同時，大量臨床研究證實，連翹對中度和輕度抑郁癥有效，其副作用較傳統(tǒng)的抗抑郁藥物更溫和[10]。

黃酮類化合物是連翹果實中主要有效成分之一，由色原烷或色原酮衍生而來，廣泛分布在植物的各個部位，是植物中的次級代謝產(chǎn)物[4]。黃酮類化合物可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低血清膽固醇、清除生物體內(nèi)自由基、改善血液循環(huán)、抗肝臟毒性等，同時能夠增強免疫力，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，對治療心血管疾病也有一定效果[10]，在食品、藥品、保健品等方面應用廣泛。

黃酮類物質(zhì)種類多且分布廣，對它進行提取有許多方法，如超聲輔助有機溶劑提取法、微波輔助法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法、纖維素酶解法、濁點萃取法、大孔樹脂吸附法等[4，11-13]，這些方法分別在不同程度上存在安全性不足、對溫度要求嚴格、操作流程復雜、用時較長、應用范圍有限、分離效果差等缺點。而閃式提取法利用高速剪切攪拌振動、超動分子滲濾與負壓過濾等技術，在室溫和溶劑存在下，把植物藥用部位在幾秒內(nèi)破碎成細顆粒，在短時間內(nèi)使組織細胞內(nèi)外的有效成分達到動態(tài)平衡，最后用過濾的方法實現(xiàn)總黃酮提取[14]。閃式提取法用時短、效率高，在常溫條件下即可完成，使用方便且不受熱破壞，適用范圍廣泛，能最大限度地保留植物有效成分，結構緊湊，使用安全可靠[15]。

響應面法（RSM）利用合理試驗獲得數(shù)據(jù)構建多元二次回歸方程，分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)?？捎糜诮鉀Q多變量問題，在生物學、化學、食品科學等領域廣泛應用。相較于傳統(tǒng)的正交設計等方法，響應面法構造了明確的函數(shù)表達式，得到的最優(yōu)方案更精確。

本試驗首次利用閃式提取法提取連翹果實中的總黃酮，選取液料比、閃式提取時間、閃式提取電壓這3 個單因素，利用響應面法建立模型，為優(yōu)化連翹果實中黃酮的工業(yè)提取工藝提供一定的理論參考，也為提升黃酮的利用價值、獲得更高的經(jīng)濟收益提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試連翹品種為青翹，采購于山西省臨汾市古縣。將連翹放入60 ℃干燥箱中烘干以除去水分，直至用電子天平稱量為恒質(zhì)量。將干燥后的連翹果實通過粉碎機粉碎成粉末，過0.42 mm 篩，密封入潔凈的藍蓋瓶，儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線制作方法 取蘆丁標準品20.00 mg，加入適量60%乙醇，振蕩搖晃以充分溶解，完全轉(zhuǎn)移并用60%的乙醇定容到100 mL，得到0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，存放于4 ℃冰箱備用[2，16]。

取6 個25 mL 容量瓶，分別加入0、1、2、3、4、5 mL 蘆丁標準液，加入5%NaNO2溶液各0.3 mL，搖勻并靜置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液各0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，搖勻，靜置15 min[17]，以不含蘆丁標準液的溶液為空白對照，在510 nm 波長下測吸光度值，生成蘆丁標準曲線[11]。

1.2.2 連翹果實總黃酮的提取 準確稱取2.00 g上述連翹果實粉末于藍蓋瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，用閃式提取器在110 V 電壓下提取80 s。將得到的懸濁液完全轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，經(jīng)6 000 r/min離心6 min，將上清液轉(zhuǎn)入潔凈的藍蓋瓶，即可得到連翹果實試液，存放于4 ℃冰箱中，待測。

1.2.3 連翹果實總黃酮的測定 精密量取連翹果實試液2 mL，移入25 mL 容量瓶中，用移液槍吸取0.3 mLNaNO2溶液，加入容量瓶中，搖勻，靜置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，搖勻并靜置15 min。將容量瓶中的溶液移入離心管中，經(jīng)6 000 r/min 離心6 min 后，轉(zhuǎn)移上清液至潔凈的藍蓋瓶內(nèi)，稀釋10 倍后在510 nm 波長處測定吸光度值，并計算提取率。

式中，E 為總黃酮提取率；C 表示提取液中的總黃酮濃度（mL/g）；V 表示提取液的體積（mL）；n 表示提取液的稀釋倍數(shù)；m 表示配制連翹果實試液時使用的藥粉質(zhì)量（g）。

1.3 單因素試驗

1.3.1 液料比試驗 確定試驗所用液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，由于需要將閃式提取器破碎提取刀頭浸入試液液面以下，在潔凈的藍蓋瓶中分別準確稱取4.00、3.00、2.00、2.00、2.00 g連翹果實粉末，并分別加入40、45、40、50、60 mL 的60%乙醇溶液，搖勻，在閃式提取電壓100 V 的條件下提取90 s。將獲得的試液轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，經(jīng)6 000 r/min 離心6 min 后，將上清液分別倒入5 個潔凈的藍蓋瓶，密封儲存在4 ℃冰箱中待測。

準備6 個潔凈干燥的25 mL 容量瓶，向其中5 個分別加入上一步制得的連翹果實試液各2.00 mL，另外1 個容量瓶作為對照。用移液槍分別量取5%NaNO2溶液0.3 mL 加入容量瓶中，搖勻并靜置6 min；分別加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；再分別向各個容量瓶中加入4%NaOH 溶液4 mL，并用60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。將所得的溶液轉(zhuǎn)入離心管，6 000 r/min 離心6 min 后得到上清液。將其稀釋10 倍并檢測510 nm 波長下的吸光度。計算連翹果實中總黃酮提取率，確定最佳液料比。

1.3.2 乙醇濃度試驗 設置閃式提取時間、閃式提取電壓、連翹果實試液液料比分別為90 s，110 V，25∶1。向5 個藍蓋瓶中分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，剩余步驟同1.3.1，確定最佳乙醇濃度。

1.3.3 閃式提取時間試驗 設置閃式提取電壓、連翹果實試液液料比、乙醇濃度分別為110 V，25∶1，60%。分別閃式提取70、80、90、100、110 s，剩余步驟同1.3.1，確定最佳閃式提取時間。

1.3.4 閃式提取電壓試驗 設置閃式提取時間、連翹果實試液液料比、乙醇濃度分別為80 s，25∶1，60%。分別在90、100、110、120、130 V 下提取，剩余步驟同1.3.1，確定最佳閃式提取電壓。

1.4 響應面試驗設計

分析單因素試驗結果可以得出，液料比、閃式提取時間和閃式提取電壓這3 個單因素對連翹果實中黃酮類物質(zhì)的提取率有較大影響。利用Design-Export 8.0.6 軟件中的Box-Behnken 程序，進行三因素三水平的試驗設計，以確定連翹果實中總黃酮提取的最佳工藝。所設計的試驗因素及編碼列于表1。

表1 響應面試驗因素及編碼

1.5 統(tǒng)計分析方法

整個試驗過程均至少重復3 次，并采用Microsoft Excel 及SPSS 17.0 進行標準差計算及顯著性差異分析。單因素試驗中連翹總黃酮提取率結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 繪制蘆丁標準曲線

圖1 結果顯示，蘆丁標準曲線的回歸方程為y＝9.025x-0.003（R2＝0.999 6）。其中，自變量x 代表蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），因變量y 為吸光度A。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 液料比對連翹果實總黃酮提取率的影響由圖2 可知，當液料比為10∶1～25∶1（mL/g）時，連翹果實總黃酮的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢；而在25∶1～30∶1 的區(qū)間則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，液料比為25∶1 時，連翹果實試液中總黃酮達到峰值。因此，可選擇連翹果實試液的液料比25∶1 作為最適液料比。

2.2.2 乙醇濃度對連翹果實總黃酮提取率的影響對圖3 的分析表明，乙醇濃度在40%～50%時連翹果實總黃酮的提取率平緩上升，在50%～60%提取率幾近持平而略有極小幅的升高，高于60%則呈下降趨勢。因此，乙醇濃度為60%時連翹果實總黃酮的提取率達到峰值。

2.2.3 閃式提取時間對連翹果實總黃酮提取率的影響 分析圖4 可知，提取時間為70～80 s 時，連翹果實總黃酮的提取率較大幅上升，在80～90 s 有明顯的下降趨勢，而在90 s 之后連翹果實總黃酮提取率的下降漸漸趨于平緩。因此，提取時間為80 s時連翹果實黃酮提取率最高。

2.2.4 閃式提取電壓對連翹果實總黃酮提取率的影響 分析圖5 可知，提取電壓為90～110 V 時，連翹果實黃酮的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢，電壓在110 V 后連翹果實的提取率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，提取電壓為110 V 時連翹果實黃酮提取率最高。

2.3 響應面結果分析

對閃式提取連翹果實中總黃酮的條件進行優(yōu)化，試驗方案及其結果列于表2。

表2 試驗設計及測定結果

分析表2 中的數(shù)據(jù)可得如下回歸方程。

式中，Y 表示連翹果實總黃酮提取率。

對回歸方程進行方差分析，結果列于表3。對回歸方程以及表3 中數(shù)據(jù)進行分析，可得失擬項＝0.104＞0.05，說明該模型擬合程度良好；均方差P＜0.000 1，小于0.05，表明回歸模型顯著。CV＝1.11%，說明試驗精確度良好；信噪比＝15.732＞3，表明該模型對連翹果實中總黃酮提取率的分析和預測結果較為準確；R2＝0.981 2，表明該模型擬合程度較高。

表3 回歸方程的方差分析

對回歸模型進行顯著性分析，所得模型的一次項A、C 顯著（P＜0.05），B 不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2均顯著（P＜0.05）。各單因素對連翹果實總黃酮提取率的影響大小：A＞C＞B，即連翹果實試液液料比＞閃式提取電壓＞閃式提取時間。

2.4 多因素間交互作用分析

由圖6～8 可知，連翹果實試液液料比和閃式提取時間2 個因素之間存在明顯的交互作用，連翹果實試液液料比與閃式提取電壓之間也有著較為明顯的交互作用，而閃式提取時間與閃式提取電壓之間交互作用不明顯。連翹果實總黃酮提取率受連翹果實試液液料比的影響最大，在25∶1～30∶1的某點提取率最高，閃式提取電壓在100～110 V的某電壓下連翹果實總黃酮提取率最高，而閃式提取時間在70～80 s 的某時刻有最高提取率。

2.5 驗證試驗結果分析

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化分析獲得從連翹果實中提取總黃酮的最優(yōu)工藝如下：液料比為27.34∶1、閃式提取時間為79.84 s、閃式提取電壓為108.87 V，在此條件下，連翹果實總黃酮提取率理論值為18.256%。由于儀器精度等條件的限制，故采用連翹果實試液液料比為27∶1、閃式提取時間為80 s、閃式提取電壓為109 V 進行3 次驗證試驗，得到連翹果實總黃酮提取率實際均值為18.030%，較為接近響應面軟件分析所得到的理論值。由此可認為，此試驗模型選擇合理，試驗結果理想。

3 結論與討論

在研究乙醇濃度這一單因素時發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度對連翹果實總黃酮提取率的影響不大。乙醇濃度較低時提取率與乙醇濃度基本成正比，乙醇濃度在50%～60%時達到最高值并保持基本持平，而后逐漸下降，考慮到節(jié)能、高效等因素，在設計響應面試驗時舍去該單因素[18-20]。

響應面法分析得出利用閃式提取法提取連翹果實中的總黃酮最優(yōu)工藝為：液料比27.34∶1，提取時間為79.84 s，提取電壓為108.87 V，此條件下所得理論提取率為18.256%。利用超聲提取法提取連翹果實中總黃酮的試驗所得到的最佳提取工藝為：超聲功率66.2%，溫度57.2 ℃，乙醇濃度56.2%，超聲提取40 min，所得理論最佳提取率為15.08%[19]。比較2 種提取方法，可以發(fā)現(xiàn)，閃式提取法所需時間更短，室溫下即可進行提取，操作簡單易行，并且可以獲得更高的提取率。

此外，正交試驗設計也廣泛應用于優(yōu)化提取工藝中[1，21-23]，但它作為線性數(shù)學模型所設計的設計方法，只能分析離散性數(shù)據(jù)。響應面法則采用非線性模型，可以在給出的區(qū)域找到明確的回歸方程，從而找到整個區(qū)域提取工藝的最優(yōu)值，預測性更好。

通過單因素試驗以及響應面設計模型，比較液料比、閃式提取時間、閃式提取電壓等條件對連翹果實總黃酮提取率的影響，得到閃式提取連翹果實中總黃酮的最優(yōu)方案。結果表明，各單因素對提取率的影響為：液料比＞閃式提取電壓＞閃式提取時間。從連翹果實中提取黃酮的最優(yōu)工藝：液料比為27∶1、閃式提取時間為80 s、閃式提取電壓為109 V，連翹果實總黃酮提取率的實際均值為18.030%。研究結果可為優(yōu)化連翹果實中總黃酮的提取工藝提供一定的理論參考。