藥物性肝損傷伴自身免疫現(xiàn)象患者血清γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10水平及其單核苷酸多態(tài)性

任 姍， 杜曉菲， 黃云麗， 黃春洋， 張曉丹， 單 晶， 陳新月

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病免疫科， 北京 100069

由于藥物、保健品的頻繁使用及環(huán)境毒物等多種因素的影響，藥物性肝損傷(DILI)發(fā)病率呈逐年上升趨勢，部分患者病情反復(fù)，起病即出現(xiàn)重癥化趨勢，是近年來急性肝衰竭的主要原因之一[1]。越來越多數(shù)據(jù)證實(shí)DILI與人類白細(xì)胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ類基因遺傳多態(tài)性相關(guān)，表明適應(yīng)性免疫在DILI中發(fā)揮重要作用[2-6]。γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon γ-induced protein 10,IP-10)作為趨化因子(CXC)家族中一員，與其受體CXCR3相互作用，趨化及激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，發(fā)揮抗感染、抑制病毒等多種生物學(xué)功能。近年來有研究[7-8]顯示IP-10參與了狼瘡腎炎、自身免疫性肝炎等多種自身免疫性疾病進(jìn)展，但在DILI中的表達(dá)少有研究。本研究通過檢測血清IP-10水平及其基因多態(tài)性，探討IP-10聯(lián)合宿主單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)對DILI伴自身免疫現(xiàn)象的鑒別意義，旨在為DILI的診斷、預(yù)防及治療提供新的依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年10月至2019年6月于本院肝病免疫科診治的DILI患者168例作為研究對象，DILI診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會《藥物性肝損傷診治指南》[9]推薦的RUCAM 量表：超過8分為高度可能；6～8分為可能性大；3～5分為可能；1～2分為不太可能，等于或小于0分除外診斷；本研究納入評分≥6分的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并病毒性肝炎(包括HAV、HBV、HCV、HEV、巨細(xì)胞病毒、EB病毒)和HIV等感染；(2)合并自身免疫性、遺傳代謝性、脂肪性或酒精性肝病；(3)合并惡性腫瘤；(4)靜脈藥癮者；(5)合并風(fēng)濕性疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾??；(6)4周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑者。本研究方案得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號：LL-2018-131-K)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集及標(biāo)本收集 收集患者臨床資料，包括一般情況、合并用藥、主要癥狀和體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、治療方案、臨床轉(zhuǎn)歸等。所有入組患者均于治療基線留取全血、血清，于-80 ℃保存以備檢測SNP及IP-10水平。

1.3 病例分組 DILI伴自身免疫現(xiàn)象組，即AI-DILI組，依據(jù)自身免疫性肝炎(AIH)簡化診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-12]，選取分?jǐn)?shù)4～6分的患者[包括抗核抗體(ANA)/抗平滑肌抗體(SMA)/抗肝腎微粒體抗體(抗LKM)-1陽性或IgG升高或病理提示界面炎]；非AI-DILI組為分?jǐn)?shù)<4分。

AIH簡化診斷標(biāo)準(zhǔn)參考國際自身免疫性肝炎小組( IAIHG) 2008年AIH 簡化積分系統(tǒng)：自身抗體、血清 IgG 水平、肝臟組織學(xué)變和排除病毒性肝炎四個項目進(jìn)行評分，每個項目最高計2分，共計8分：6～7分為“可能”的AIH，>7分可確診AIH。

1.4 檢測方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)室檢測 血清生化學(xué)指標(biāo)： ALT、AST、ALP、TBil、DBil、GGT、Alb、總蛋白(TP)采用OLMPUS-AU5400生化檢測儀；免疫學(xué)指標(biāo)：血清IgG 和IgM采用美國 Beckman coulter Array 360 全自動特種蛋白分析儀檢測。自身免疫性肝病相關(guān)抗體:ANA、SMA、抗LKM、抗線粒體抗體(AMA)、抗可溶性肝抗原抗體/抗肝-胰抗體(SLA/LP)、抗SP100和抗gp210采用ELISA及免疫印跡法(試劑購自德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司)。

1.4.2 IP-10及SNP檢測 血清IP-10水平檢測：采用液相芯片技術(shù)(Luminex技術(shù))，Bio-Plex 200 system(美國Bio-Rad公司)。IP-10(rs56061981位點(diǎn))SNP分型：TaqMan探針基因分型，上?；倒緳z測(羅氏LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR儀，LCS480 1.5.1.62軟件進(jìn)行基因分型)。

1.4.3 超聲引導(dǎo)下肝穿刺活組織檢查 超聲引導(dǎo)下肝穿刺活組織檢查患者102例：B 超引導(dǎo)下MAGNUM活檢系統(tǒng)(Bard Peripheral Vascular, Inc, 美國)經(jīng)皮穿刺取肝組織，穿刺肝組織長度>1.0 cm；10%中性福爾馬林液固定標(biāo)本及石蠟包埋。4 μm 連續(xù)切片，分別做HE、Masso三色、Gomori網(wǎng)織纖維和D-PAS染色。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 168例DILI患者中男56例，女112例；年齡19～70歲，平均(47.3±12.5)歲。其中AI-DILI組72例，男22例，女50例；年齡19～69歲，平均(48.0±12.0)歲。非AI-DILI組96例，男34 例，女62例；年齡22～70 歲，平均(50.6±11.2)歲，兩組患者在年齡、性別構(gòu)成比上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。用藥情況分析：患者中應(yīng)用中草藥/中成藥及膳食補(bǔ)充劑74例(44.05%)，其中應(yīng)用較多的有治療皮膚病、骨科疾病藥物及染發(fā)劑、膳食補(bǔ)充劑。應(yīng)用解熱鎮(zhèn)痛藥28例(16.67%)，抗微生物藥21例(12.50%)，降脂藥16例(9.52%)，調(diào)節(jié)血糖藥11例(6.55%)，抗腫瘤藥(化療藥及靶向藥)8例(4.76%)，廣譜抗病毒藥6例(3.57%)，抗癲癇藥4例(2.38%)。

2.2 AI-DILI組與非AI-DILI組臨床指標(biāo)比較 兩組間AST及IgG水平差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。在自身抗體檢測方面：AI-DILI組自身抗體陽性有66例(91.67%)，依據(jù)發(fā)生比例的高低分別是ANA、SMA、ACA、SSA/SSB、細(xì)胞骨架抗體、APCA。非AI-DILI組合并自身抗體陽性12例(12.5%)，兩組之間合并自身抗體陽性的比例存在顯著差異 (χ2=103.8，P<0.05)。168例患者中有64例(AI-DILI組38例，非AI-DILI組26例)為重度肝損傷[TBil≥5×ULN(85.5 μmol/L)，伴或不伴 INR≥ 1.5]，其余均為輕度及中度肝損傷，均予以保肝支持治療。重度肝損傷患者應(yīng)用甲強(qiáng)龍的劑量為(0.65± 0.15)mg·kg-1·d-1，屬于中小劑量，激素應(yīng)用后首次調(diào)整劑量時間(減量或停用)為(8.0±4.1)d，其中直接停用28例，逐漸減量36例[應(yīng)用時間<1月(短療程)21例，3月內(nèi)(中療程)15例]。所有患者隨訪時間為3～17個月，62例(36.9%)患者出現(xiàn)病情反復(fù)(ALT或TBil波動)，但其AIH 簡易評分均未達(dá)到 AIH 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 AI-DILI組與非AI-DILI組血清生化學(xué)指標(biāo)及免疫指標(biāo)

2.3 IP-10基因多態(tài)性(rs56061981)與DILI臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 IP-10基因rs56061981位點(diǎn)基因型頻率與人種關(guān)系并不顯著(依據(jù)NCBI官方SNP數(shù)據(jù))：C等位基因在非洲人群比例略低，其余如亞洲人群或歐洲人群比例較高(86.38% vs 93.33%,P=0.07)。本研究顯示，CC基因型在DILI患者中的分布頻率與一般人群[13]相當(dāng)(69.05% vs 78.89%，P=0.43),而且攜帶C等位基因也在二者間大致相同(78.57% vs 88.98%，P=0.25)(表2)。這提示IP-10基因多態(tài)性似乎并不能影響DILI的易感性以及人群的分布差異性。

AI-DILI組的患者CC基因型頻率顯著高于非AI-DILI組(χ2=4.592，P=0.03)，同時AI-DILI組攜帶C等位基因頻率顯著高于非AI-DILI組(χ2=4.41，P=0.04)(表2)。

2.4 DILI治療過程中血清IP-10表達(dá)的變化 AI-DILI患者基線IP-10水平顯著高于非AI-DILI患者[(627.99±198.07] pg/ml vs (378.13±218.45) pg/ml，t=7.34,P<0.05](圖1a)，且與基線AST水平及AIH評分呈正相關(guān)(r值分別為0.67、0.79，P值均<0.05)。

隨著治療進(jìn)展，所有患者2周時IP-10水平逐漸下降，4周時IP-10水平顯著下降，12周及治療結(jié)束時IP-10水平相接近，整體的變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.305，P<0.05)(圖1b)；分組分析顯示其變化趨勢在AI-DILI組更為明顯(F=9.42，P<0.05)，與基線比較治療2周時AI-DILI組水平顯著下降[(627.99±198.07) pg/ml vs (423.14±221.65) pg/ml，t=7.62，P=0.04)，繼續(xù)治療至4周IP-10水平降至(311.23±171.90)pg/ml，12周及治療結(jié)束時分別為(230.73 ±128.26)pg/ml和(208.33±68.95)pg/ml(圖1c)；非AI-DILI組的變化趨勢無顯著差異(F=1.07，P=0.23)(圖1d)。

表2 IP-10 rs56061981基因型及等位基因在不同組間的分布頻率

注：a，2組患者IP-10水平比較；b，所有患者IP-10變化；

2.5 基線血清IP-10的水平預(yù)測AI-DILI 基于ROC曲線進(jìn)一步分析基線IP-10水平對DILI伴自免現(xiàn)象的預(yù)測作用，結(jié)果顯示，基線IP-10預(yù)測AI-DILI的ROC曲線下面積為0.832，敏感度、特異度分別為0.846、0.867，最佳閾值為527.03 pg/ml(圖2)。

2.6 血清IP-10水平聯(lián)合IP-10基因多態(tài)性預(yù)測AI-DILIIP-10 rs56061981位點(diǎn)CC基因型在AI-DILI組分布頻率顯著高于非AI-DILI組，故進(jìn)一步分析IP-10 CC基因型及血清IP-10變化聯(lián)合預(yù)測DILI伴自身免疫現(xiàn)象。在IP-10 CC基因型的116例患者中，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有51例(43.97%)，≥527.03 pg/ml的患者65例(56.03%)，而在52例CT/TT基因型患者中，<527.03 pg/ml的患者有32例(61.54%)，≥527.03 pg/ml的患者20例(38.46%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.89，P=0.03)(圖3a)。而且，CC基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml的有80%(52/65)為AI-DILI，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有7.8%(4/51)為AI-DILI；而在CT/TT基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml的患者僅有50%(10/20)為AI-DILI，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的有31.25%(6/32)為AI-DILI，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為13.28、59.80，P值分別為0.006、<0.01)(圖3b)。聯(lián)合CC基因型及基線IP-10≥527.03 pg/ml，預(yù)測AI-DILI發(fā)生的陽性預(yù)測值為92.84%，陰性預(yù)測值為86.33%。

圖3 IP-10基因多態(tài)性(rs56061981)結(jié)合基線IP-10水平

3 討論

2010年Russmann等[14]研究顯示，宿主遺傳易感背景以及適應(yīng)性免疫在DILI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，提示炎性細(xì)胞因子的釋放及相互作用貫穿于整個DILI發(fā)生、發(fā)展的全過程，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，主要包括IL、干擾素及趨化因子等。而IP-10作為CXC趨化因子家族中重要的炎癥因子，能夠特異性活化表達(dá)CXCR3的相關(guān)細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化，并與干擾素相互協(xié)同，在各種肝臟疾病中發(fā)揮促炎作用，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及刀豆蛋白A誘導(dǎo)的DILI[15]。而宿主基因多態(tài)性現(xiàn)象，尤其是基因啟動子區(qū)的SNP可以影響細(xì)胞因子的表達(dá)，從而使宿主對抗原免疫反應(yīng)的強(qiáng)度存在一定差異。通過細(xì)胞因子發(fā)揮免疫效能是宿主免疫系統(tǒng)執(zhí)行效應(yīng)的主要方式，故選擇宿主目的基因時，宿主基因多態(tài)性的不同需要進(jìn)一步結(jié)合其下游抗病毒蛋白或者細(xì)胞因子表達(dá)差異進(jìn)行綜合分析[16-18]。

首先，本研究顯示IP-10 SNP的確會影響IP-10血清水平表達(dá)差異：IP-10基因rs56061981位點(diǎn)CC基因型患者其基線IP-10表達(dá)顯著高于非CC基因型，這與最近研究[19-20]結(jié)果一致，IP-10啟動子區(qū)rs56061981位點(diǎn)的突變改變了核內(nèi)蛋白的親和力進(jìn)而調(diào)節(jié)IP-10的表達(dá)，將增強(qiáng)IP-10的轉(zhuǎn)錄和肝臟炎癥反應(yīng)，使男性慢性乙型肝炎患者干擾素治療效果提高，出現(xiàn)HBeAg及HBsAg滴度下降，將是一個新的潛在性的SNP位點(diǎn)。其次，本研究顯示IP-10基因rs56061981位點(diǎn)CC基因型在AI-DILI組的分布頻率顯著高于非AI-DILI組。第三，本研究也顯示AI-DILI組患者IP-10水平顯著高于非AI-DILI組，隨著治療的進(jìn)行，DILI患者血清IP-10水平總的變化趨勢為：2周時IP-10水平開始下降，4周時明顯低于基線水平，12周及治療結(jié)束時IP-10水平相接近；進(jìn)一步依據(jù)分組分析顯示，該變化趨勢在AI-DILI組更為顯著，而非AI-DILI組各治療時間點(diǎn)IP-10變化不具備統(tǒng)計學(xué)差異。

基于上述相關(guān)性，將宿主IP-10基因多態(tài)性結(jié)合其細(xì)胞因子表達(dá)水平共同來預(yù)測DILI伴自身免疫現(xiàn)象的發(fā)生。CC基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml有80%(52/65)為AI-DILI，CC基因型聯(lián)合基線IP-10≥527.03 pg/ml預(yù)測AI-DILI的效能顯著提高。迄今為止，IP-10 SNP是否確定影響血清IP-10水平的表達(dá)，二者是否與AI-DILI易感性有關(guān)鮮有報道，本研究顯示這二者與AI-DILI的發(fā)生密切相關(guān)。Xie等[21]研究也提示IP-10血清表達(dá)水平與DILI的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，并依據(jù)該指標(biāo)建立模型對DILI嚴(yán)重程度進(jìn)行預(yù)測。另外，也有研究[22]顯示，IP-10還可用于預(yù)測急性HIV感染時CD4+T淋巴細(xì)胞下降趨勢以及疾病的進(jìn)展，而IP-10 rs56061981位點(diǎn)可作為潛在保護(hù)性SNP位點(diǎn)預(yù)測肺結(jié)核患者疾病嚴(yán)重程度，聯(lián)合IP-10 水平其預(yù)測價值更為顯著[23]。

當(dāng)AI-DILI與AIH鑒別診斷存在困難時,可使用糖皮質(zhì)激素,觀察對激素的應(yīng)答效果,前者應(yīng)答更快,需要的劑量也較小,最為重要的是停用糖皮質(zhì)激素不會出現(xiàn)病情的反復(fù),而后者停用激素會出現(xiàn)病情反復(fù)。故在臨床表現(xiàn)及病理學(xué)上鑒別診斷存在困難時，治療后隨訪是鑒別的重要手段。本研究隨訪時間為3～17個月，但還需要長期隨訪進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)了IP-10在鑒別診斷DILI伴自身免疫現(xiàn)象的臨床意義，同時IP-10基因多態(tài)性將影響血清IP-10水平的表達(dá)，二者聯(lián)合預(yù)測AI-DILI的效能顯著提高。除了聯(lián)合宿主基因多態(tài)性及其下游編碼的蛋白表達(dá)水平共同預(yù)測以外，筆者將在之后的AI-DILI發(fā)病機(jī)制研究中論證作為效應(yīng)細(xì)胞因子，IP-10聯(lián)合干擾素γ影響CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞1的功能。