譚 鵬, 陳 浩, 王安康, 錢保林, 黃治偉, 石 昊, 高 琳, 付文廣,
西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a. 四川省院士(專家)工作站; b. 肝膽外科; c. 健康管理中心, 四川 瀘州 646000
慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一種進(jìn)展性炎癥性疾病,在我國發(fā)病率約為13/105,且呈上升趨勢,其中約2.9%的新診斷患者在1年內(nèi)被確診為胰腺癌[1]。CP的基本病理特征表現(xiàn)為不可逆的胰腺實(shí)質(zhì)慢性炎癥損害、間質(zhì)纖維化及腺泡細(xì)胞萎縮消失,病程遷延且預(yù)后不良,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。雷公藤甲素作為環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物,又稱雷公藤內(nèi)酯醇,是中藥雷公藤中的主要活性成分之一[3]。近年來的研究[4-6]表明,其具有諸多藥理活性,如抗癌、抗氧化、抗類風(fēng)濕、抗老年性癡呆癥等。然而,目前尚無報(bào)道雷公藤甲素具有抗CP的藥理活性。本研究以雨蛙素誘導(dǎo)的CP小鼠模型為研究對象,基于NF-κB/IL-6信號通路,探索雷公藤甲素緩解CP發(fā)生的機(jī)制,闡明其新的藥理活性。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級C57BL/6雄性小鼠15只,體質(zhì)量(20±2)g,6~8周齡,購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號:SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物房,許可證號:SYXK(川)2018-065。本研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批(批號:201906-4),符合實(shí)驗(yàn)室動物管理與使用準(zhǔn)則。
1.2 主要試劑 雨蛙素、雷公藤甲素購自MCE (美國),小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems(美國),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Beyoeime(中國),天狼猩紅、馬松染色試劑盒購自Solarbio(中國),NF-κB/p65兔多克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購自Proteintech(中國),IL-6兔多克隆抗體購自Servivebio(中國),α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)兔多克隆抗體購自abcam(英國),二抗購自Proteintech(中國)。
1.3 CP小鼠模型的構(gòu)建及分組 15只6~8周齡C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,隨機(jī)分為3組:對照組、雨蛙素組和雷公藤甲素組,每組各5只。雨蛙素組和雷公藤甲素組10只小鼠均給予腹腔雨蛙素注射50 μg/kg,每周注射3 d,6 次/d,每次間隔1 h,連續(xù)注射6周,構(gòu)建CP模型,其中雷公藤甲素組5只小鼠在第3周開始同時(shí)腹腔注射100 μg/kg的雷公藤甲素,每周注射6 d,1 次/d,連續(xù)注射4周。對照組接受同雨蛙素組等劑量、同頻率的0.9%生理鹽水。所有小鼠均為第6周處理結(jié)束后處死。
1.4 樣本采集及檢測方法
通過外科手術(shù)摘除小鼠完整胰腺組織,稱重后取胰腺中部組織將其平均分成2份,1份置于4%多聚甲醛中用于組織學(xué)檢測;1份迅速置于液氮中,再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱,待提取蛋白行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)檢測。
1.4.1 胰腺組織病理學(xué)染色 胰腺組織HE染色觀察病理改變,并采用Kusske評分標(biāo)準(zhǔn)[7]對其進(jìn)行定量評估;天狼猩紅染色及馬松染色觀察胰腺組織纖維化程度,通過Image J 1.43軟件計(jì)算胰腺組織天狼星紅染色紅色信號及馬松染色藍(lán)色信號的平均光密度值。
首先將胰腺組織在4%多聚甲醛中固定24 h,然后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,最后通過切片機(jī)制作4 μm石蠟切片。使用HE染色、天狼猩紅染色、馬松染色試劑盒并按照說明書步驟進(jìn)行檢測。
1.4.2 ELISA檢測血清中IL-6表達(dá) 在造模最后1 d通過摘除眼球法收集3組小鼠血液,室溫靜止放置30 min,3000 r/min離心15 min,吸取上清,使用小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒并按照說明書步驟進(jìn)行檢測。
1.4.3 免疫組化檢測α-SMA和NF-κB/p65 α-SMA為公認(rèn)的纖維化程度的指標(biāo),NF-κB/p65為轉(zhuǎn)錄調(diào)控IL-6表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,通過免疫組化染色觀察其在胰腺組織中的表達(dá)情況,并通過ImageJ 1.43軟件計(jì)算陽性信號的平均光密度值。
對4 μm胰腺組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,通過枸櫞酸鈉緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù),3%H2O2室溫孵育5~10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,用10%山羊血清對切片進(jìn)行封閉。使用NF-κB/p65抗體(1∶100)、α-SMA抗體(1∶100)于4 ℃孵育過夜,切片用PBS沖洗3次,二抗孵育1 h,使用DAB顯色液進(jìn)行顯色,待顯色完全后用蒸餾水洗終止反應(yīng)。依次通過蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、脫水透明,最后用中性樹膠封片。
1.4.4 WB檢測NF-κB/p65、IL-6及α-SMA 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達(dá),并通過ImageJ 1.43軟件進(jìn)行灰度值分析。使用RIPA強(qiáng)裂解液(Beyotime)并按照說明書步驟進(jìn)行胰腺組織的蛋白提取,通過BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)對樣品進(jìn)行濃度測定。制備聚丙烯酰胺凝膠,依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗于4 ℃孵育過夜,然后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h,通過使用凝膠成像分析儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。
2.1 胰腺組織重量比較 3組間胰腺組織重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),雨蛙素組顯著低于對照組和雷公藤甲素組(P值均<0.05)(表1)。
2.2 胰腺組織病理學(xué)染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,3組間胰腺組織病理評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 與對照組比較,雨蛙素組胰腺腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤程度更為嚴(yán)重(P<0.05);與雨蛙素組比較,雷公藤甲素組腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤顯著緩解(P<0.05)(表1,圖1)。
表1 3組小鼠各項(xiàng)結(jié)果比較
注:與對照組比較,1)P<0.05;與雨蛙素組比較,2)P<0.05。
注:a,對照組; b,雨蛙素組; c,雷公藤甲素組。
圖1各組小鼠胰腺組織的病理學(xué)改變(HE染色,×200)
天狼猩紅染色及馬松染色結(jié)果顯示,3組間天狼星紅染色紅色信號、馬松染色藍(lán)色信號的平均光密度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。與對照組比較,雨蛙素組胰腺組織膠原纖維表達(dá)顯著升高(P值均<0.05);與雨蛙素組比較,雷公藤甲素組胰腺組織膠原纖維表達(dá)明顯降低(P值均<0.05)(表1,圖2、3)。
注:a,對照組; b,雨蛙素組; c,雷公藤甲素組。
圖23組小鼠胰腺組織的天狼猩紅染色(×200)
注:a,對照組; b,雨蛙素組; c,雷公藤甲素組。
圖33組小鼠胰腺組織的馬松染色(×200)
2.3 血清IL-6水平的比較 ELISA檢測結(jié)果顯示,3組間IL-6水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組血清IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05);與雨蛙素組相比,雷公藤甲素組血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)(表1)。
2.4 胰腺組織α-SMA和NF-κB/p65免疫組化結(jié)果 3組間α-SMA陽性信號平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織α-SMA蛋白的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05);與雨蛙素組比較,雷公藤甲素組α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表1,圖4)。
注:a,對照組; b,雨蛙素組; c,雷公藤甲素組。
圖4各組小鼠胰腺組織α-SMA的免疫組化染色(×200)
3組間NF-κB/p65陽性信號的平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織中NF-κB/p65的表達(dá)明顯高于對照組,且明顯在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)(P<0.05);與雨蛙素組相比,雷公藤甲素組NF-κB/p65蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表1,圖5)。
注:a,對照組;b,雨蛙素組;c,雷公藤甲素組。
圖53組小鼠胰腺組織NF-κB/p65的免疫組化染色(×200)
2.5 胰腺組織WB檢測結(jié)果 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá),結(jié)果顯示,3組間NF-κB/p65、IL-6、α-SMA的相對灰度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與對照組比較,雨蛙素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá)水平明顯升高(P值均<0.05);與雨蛙素組比較,雷公藤甲素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá)水平明顯降低(P值均<0.05)(表2,圖6)。
圖63組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達(dá)
CP是各種因素(酗酒、吸煙、損傷和遺傳因素等)導(dǎo)致的一種不可逆轉(zhuǎn)的慢性炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為大量成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)在胰腺內(nèi)沉積導(dǎo)致腺泡細(xì)胞損失和胰腺進(jìn)行性纖維化[8-9]。目前臨床上對于CP的治療主要以緩解癥狀及控制并發(fā)癥為主,缺乏對CP特效的治療藥物,故治療效果不滿意[10]。因此了解CP發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,探索新的CP靶向治療藥物顯得尤為重要。雨蛙素作為膽囊收縮素的類似物,通過反復(fù)腹腔注射可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)較典型的CP病理表現(xiàn)[11],因此本研究以雨蛙素誘導(dǎo)的CP模型為基礎(chǔ)進(jìn)行相關(guān)研究。
雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分,由于其獨(dú)特的二萜三環(huán)氧化合物結(jié)構(gòu)和多種生物活性,引起了廣泛的研究和開發(fā)[12]。目前已有研究報(bào)道雷公藤甲素可以通過抑制NF-κB活性及CXCL11表達(dá)減輕重癥急性胰腺炎(severe cute pancreatitis,SAP)時(shí)胰腺組織病理損傷[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素組小鼠的腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤程度較雨蛙素組明顯緩解,且胰腺纖維化程度也顯著弱于雨蛙素組,提示,雷公藤甲素除可以治療SAP外,還可進(jìn)一步用于CP的治療。
NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,其發(fā)揮主要生理作用的是p50和p65亞基組成的異源二聚體,當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷后被激活,并參與調(diào)節(jié)多種炎性基因轉(zhuǎn)錄過程,介導(dǎo)急慢性炎癥反應(yīng)[15-17]。已有研究[18]表明,在雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP模型中NF-κB/p65表達(dá)明顯上調(diào),且受NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄調(diào)控的IL-6的表達(dá)也明顯上調(diào)。在肺部炎癥、多發(fā)性骨髓瘤、SAP的研究[19]中發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素通過抑制NF-κB通路的激活從而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),與雨蛙素組相比,雷公藤甲素組胰腺組織NF-κB/p65的表達(dá)被明顯抑制,且下游IL-6在胰腺及血清中的表達(dá)量都明顯降低。以上結(jié)果表明雷公藤甲素可能通過抑制NF-κB/p65表達(dá),進(jìn)而下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)與分泌,減緩雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP。
本研究從組織和蛋白水平進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素可以減緩雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP纖維化進(jìn)程,同時(shí)明顯抑制胰腺組織NF-κB/p65表達(dá),為胰腺纖維化及CP的靶向治療提供重要的理論基礎(chǔ),為CP的臨床治療及預(yù)防提供新的思路。
表2 3組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的灰度值比較
注:與對照組比較,1)P<0.05;與雨蛙素組比較,2)P<0.05。