孫 薇，普 珍，白瑪多吉，白瑪央吉，安 芳，石 艷，龔嘎藍(lán)孜*

(1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩850000；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院 眼科，西藏 拉薩850000；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021)

青藏高原平均海拔在4500米以上，由于地勢(shì)高而具有低壓、低氧、高寒等氣候特點(diǎn)[1]。隨著我國(guó)西部大開發(fā)的戰(zhàn)略實(shí)施，越來越多的人群進(jìn)入高原工作、學(xué)習(xí)、旅游、生活。人體進(jìn)入高原后會(huì)通過一系列代償反應(yīng)來適應(yīng)高原環(huán)境，而部分失代償者，會(huì)出現(xiàn)頭暈、頭疼、乏力、惡心等癥狀，嚴(yán)重者可能危及生命[1]。因此，研究高原環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響將有利于高原世居者和日益增多的移居者健康，為拓寬人類生存空間以及高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。研究指出缺氧會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的穩(wěn)態(tài),尤其是胚胎在遭受缺氧的刺激后，會(huì)導(dǎo)致各種各樣的畸形和疾病，先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)就是其中的一種[2]。孕婦居住于高海拔環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致胎兒長(zhǎng)期慢性缺氧，而胎兒宮內(nèi)缺氧又是發(fā)生CHD的一個(gè)十分重要的誘因[2]。因此，本研究以移居高原孕鼠的子代為研究對(duì)象，觀察在高原低壓低氧環(huán)境下，子代大鼠臟器的發(fā)育狀況及心臟的形態(tài)學(xué)改變，以期為缺氧性疾病的防治提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡220±8 g的wistar大鼠24只(18只雌鼠，6只雄鼠)，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(川) 2015-030]。將24只大鼠平均分為高原組和平原組，每組12只(9只雌鼠，3只雄鼠)。高原組大鼠空運(yùn)到西藏拉薩(3658 m)，在西藏大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)待實(shí)驗(yàn)。平原組大鼠陸運(yùn)到昆明(1800 m)，在昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)待實(shí)驗(yàn)。從動(dòng)物到達(dá)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，每組按3:1雌雄比例合籠受孕，所有孕鼠均自然分娩。子代大鼠出生后滿4周斷乳，根據(jù)其肛門同生殖突的間距來判斷性別，進(jìn)行雌雄分籠飼養(yǎng)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室均設(shè)置環(huán)境溫度(20±2) ℃、濕度:(45±5) %、光照12小時(shí)/天，水食自由攝取。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

電子天平(上海JM-B6002，Max=600 g，d=0.01 g，測(cè)量動(dòng)物體重量),電子天平(瑞士Mettler toledo-PL203，Max=210 g，d=0.001 g，測(cè)量主要臟器重量)，正置顯微鏡(OLYMPUS日本奧林巴斯公司)，石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235德國(guó)萊卡公司)，多聚甲醛(成都市科龍化工試劑廠)，水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

高原組和平原組的子代大鼠，在出生后第1天、第30天、第60天，每組隨機(jī)處死9只子鼠，用電子天平(精確到0.01 g)測(cè)定體質(zhì)量，取出心、肝、脾、肺、腎、腦，去殘血，剝離脂肪和結(jié)締組織，用4℃預(yù)冷的0.1 mol/L,pH7.4的PBS溶液沖洗3次，濾紙吸干水分后稱凈質(zhì)量。臟器指數(shù)=臟器(g)/體重(g)×100%[3]。

1.4 心臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

各組每一時(shí)間點(diǎn)從隨機(jī)處死的9只子代大鼠中取心臟相同部位(心尖部)的一小部分置于10%的多聚甲醛固定液中，放入4℃冰箱固定12h，常規(guī)石蠟包埋，HE染色檢測(cè)病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組子代大鼠生長(zhǎng)的一般情況

各組孕鼠飲食正常，無早產(chǎn)和死亡現(xiàn)象。 高原組與平原組子代大鼠出生率基本一致，平均每窩產(chǎn)子代大鼠分別為：11-15只和12-17只，共計(jì)產(chǎn)仔分別為：109只和122只。高原組與平原組子代大鼠體重增長(zhǎng)分別為：3.87 g·d-1，4.18 g·d-1(P>0.05)。平原組子代大鼠出生第1天體重高于高原組(P<0.05)，第30天和第60天兩組間體重?zé)o差異(見表1)。高原組和平原組部分子代大鼠出現(xiàn)活動(dòng)度低、厭食現(xiàn)象，死亡率分別為4.77%和3.69%(P>0.05)。

表1 高原組與平原組子代大鼠出生后不同天數(shù)體重比較(g)

2.2 各組子代大鼠臟器指數(shù)結(jié)果

子代大鼠出生第1天，第30天、第60天肝、脾、肺、腎、腦的臟器指數(shù)兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。除第1天和第30天外，高原組第60天心臟指數(shù)高于平原組(P<0.05)(見表2)。

2.3 高原移居大鼠子代心臟HE染色結(jié)果

高原組子代大鼠心肌切片顯示有缺氧改變：心肌間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞核消失，胞質(zhì)溶解，均質(zhì)紅染，部分心肌纖維呈不規(guī)則斷裂，出現(xiàn)大小不等的空泡，心肌間隙擴(kuò)大(圖1 A)，小動(dòng)脈玻璃樣變(圖1 B)。

表2 高原組與平原組子代大鼠出生后不同天數(shù)臟器指數(shù)比較

圖1 移居高原子代大鼠心肌組織病理檢測(cè)

3 討論

我國(guó)青藏高原平均海拔在4500米以上，具有低壓、低氧、干燥及紫外線強(qiáng)等氣候特點(diǎn)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量人員從平原進(jìn)入高原進(jìn)行交流，而高原缺氧是人體是否能夠在高原正常工作、生活的重要挑戰(zhàn)。在胚胎早期各器官形成階段受環(huán)境因素影響巨大，缺氧會(huì)影響移居高原孕產(chǎn)婦的健康和胎兒生長(zhǎng)，其中心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生尤其明顯[4,5]。因此，研究高原缺氧環(huán)境對(duì)胎兒生長(zhǎng)的影響，對(duì)臨床和公共衛(wèi)生有重要意義，可以有效降低高原新生兒出生缺陷，提高出生質(zhì)量。

本研究利用青藏高原特有的地理環(huán)境條件，成功復(fù)制高原移居孕鼠模型，并對(duì)子代大鼠進(jìn)行出生率、體重、臟器指數(shù)和心臟形態(tài)學(xué)的分析比較，初步了解高原低壓低氧環(huán)境對(duì)移居高原子代大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響。通過平原組與高原組子代大鼠出生體重結(jié)果分析得知，高原組子代大鼠出生第1天體重均值低于高原組(P<0.05)，隨后高原組子代大鼠體重增長(zhǎng)比平原組低(P>0.05)，到第30天和第60天時(shí)高原組子代大鼠體重仍然低于平原組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體重是反應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，高原組子代大鼠各時(shí)間觀察點(diǎn)體重普遍比平原組低，可能跟高原缺氧在一定程度上影響生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)的高原組子代大鼠出生率比平原組低，而死亡率比平原組高，也反應(yīng)在兩組實(shí)驗(yàn)室相同溫度和濕度的條件下，平原環(huán)境氧氣充足，子代大鼠在母體內(nèi)發(fā)育良好，而高原低壓低氧環(huán)境，導(dǎo)致子代大鼠在母體內(nèi)發(fā)育受限。

臟器指數(shù)可以準(zhǔn)確地表現(xiàn)出某一臟器重量占該動(dòng)物的分量值,體重先天主要與發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)關(guān)系較大,后天主要與環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)及吸收相關(guān)[6]，本研究發(fā)現(xiàn)兩組子代大鼠出生后第1天、第30天的心、肝、脾、肺、腎、腦的臟器指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，到第60天后，高原組心臟指數(shù)比平原組高(P<0.05)，其余臟器指數(shù)無差異(P>0.05)。說明可能在高原環(huán)境生活第60天后，子代大鼠心臟便開始出現(xiàn)改變，心臟指數(shù)增大說明心臟通過心肌的增生肥大使心臟收縮力增強(qiáng)，輸出量增加，從而將更多的氧輸送到機(jī)體各個(gè)組織器官中，來代償高原環(huán)境所帶來的組織缺氧癥狀。因此，本研究通過對(duì)心臟做進(jìn)一步的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)心肌間質(zhì)內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞核消失，胞質(zhì)溶解，均質(zhì)紅染，部分心肌纖維呈不規(guī)則斷裂，出現(xiàn)大小不等的空泡，心肌間隙擴(kuò)大，小動(dòng)脈玻璃樣變。說明子代大鼠心臟確實(shí)存在缺氧的改變,這可能跟孕鼠移居高原后，受缺氧刺激導(dǎo)致子代大鼠出生后出現(xiàn)心臟的損傷有關(guān)。先天性心臟損傷會(huì)導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和心肌組織的受損，從而引發(fā)CHD的發(fā)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)CHD的發(fā)病在高原地區(qū)較為常見[7]。 高原低壓低氧的環(huán)境對(duì)胚胎心臟的生成發(fā)育有較大的影響[8]。胚胎早期心臟的發(fā)育對(duì)環(huán)境高度敏感，其細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程易受到環(huán)境因素的影響[9]。因此，建議移居高原的孕婦在高原期間應(yīng)該定期吸氧，避免因缺氧導(dǎo)致胎兒發(fā)生CHD。