基于NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化小鼠的治療作用

楊善軍 祝鵬宇 王 玥 曲齊生 曲 陽(yáng) 邢露茗 封 笑 肖 洋 樊 蓉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院1肺病科， 2針灸二病房， 3內(nèi)分泌老年病科， 哈爾濱 150001)

肺纖維化是指正常的肺部解剖結(jié)構(gòu)被活躍的重塑過(guò)程，其特征為上皮細(xì)胞損傷，成纖維細(xì)胞積聚，過(guò)度膠原沉積和基質(zhì)重塑，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)喪失，肺功能進(jìn)行性衰退，并最終導(dǎo)致死亡[1-3]。肺纖維化進(jìn)展緩慢，是高度致命的臨床事件[4-5]。肺纖維化影響我國(guó)約15萬(wàn)人，近年來(lái)發(fā)病率和死亡率均穩(wěn)步上升，沒(méi)有進(jìn)行非移植的肺纖維化患者中位生存時(shí)間約為3年[6]。炎癥反應(yīng)與肺纖維化密切相關(guān)，在肺纖維化早期階段給予肺纖維化有效治的抗炎治療如：白細(xì)胞介素4和干擾素(IFN)，可減緩肺纖維化進(jìn)展。核因子-κB(NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在許多負(fù)責(zé)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的基因的調(diào)節(jié)中起重要作用，p65是NF-κB重要基團(tuán)，研究證實(shí)NF-kB可調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程中的Th2型免疫反應(yīng)，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子IL-4增加[7]。加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯包括黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁、虎杖、丹參、沙參，其中黃芪味甘微溫，入肺脾經(jīng)，功能補(bǔ)中益氣，主治內(nèi)傷勞倦；虎杖具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效；丹參、川芎行瘀血斂新血，祛瘀生新；赤芍養(yǎng)陰潤(rùn)肺，治肺燥咳嗽，助黃芪潤(rùn)肺之功。全方標(biāo)本兼治，共奏益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、化瘀祛痰之功[8]。本研究探討加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化小鼠的治療作用及加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組在小鼠肺組織中NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組BALB/cJ小鼠120只，2～3周齡，體質(zhì)量22～25g，貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK(黔) 20170012，合格證號(hào)：SCXK(黔) 20181014]，隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松組(40.0 mg/kg)、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高組(10.0、20.0、40.0 mg/kg，預(yù)試驗(yàn)求出加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化小鼠的ED50為320.0mg/kg，以1/2 ED50為高劑量，2倍間距求出中、低劑量)雌雄各半。動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境為晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃；所有動(dòng)物自由攝取飼料、自由飲水。

1.2 藥物、儀器 及試劑注射用鹽酸博萊霉素(規(guī)格：20 mg：5 mL；日本化藥株式會(huì)社高崎工廠，H20090885)，仙琚醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207)、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院飲片藥局提供(根據(jù)成人劑量公式換算，小鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0 mL/kg體質(zhì)量灌胃，將藥液濃度配制成為8 mg/mL)。TRIzol(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)、QuantiTest SYBR Green RT-PCR Kit(Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan，56985)、NF-Kb P65一抗(目錄號(hào)13379)和GAPDH(目錄號(hào)2118)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，Inc，Danvers，MA，USA)?？雇?cat.no.sc-2054)二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，Inc、蛋白質(zhì)裂解緩沖液(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)、二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)、HYP、IL-4、TNF-α試劑盒購(gòu)于上海邦奕生物科技有限公司(ZA3654987、MN147698、LO548598)，F(xiàn)X-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)、MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電)。

1.3 小鼠肺纖維化模型的制備模型組、強(qiáng)的松組、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組小鼠在清醒狀態(tài)下，將其放入與霧化器相聯(lián)的30 cm×30 cm×20 cm透明有機(jī)玻璃盒中，通過(guò)霧化管向盒內(nèi)噴入霧化的5 g/L(50%)博萊霉素稀釋液；每次放入4只；霧化總時(shí)間為3 h，每次霧化15 min后，間斷5 min再次霧化[9]。對(duì)照組以等量0.9%氯化鈉注射液霧化，造模方法同前。造模后第2 d起給予0.9%氯化鈉注射液灌胃(0.2 mL/20 g)；模型組于造模后第2天起給予0.9%氯化鈉注射液灌胃(0.2 mL/20 g)；強(qiáng)的松組及加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組分別于造模后第2 d起給予醋酸強(qiáng)的松混懸液(0.32 mg/mL)、以及各劑量的加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯(10、20、40 mg/mL)灌胃，連續(xù)14 d。試驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，獲取肺組織進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 小鼠肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別評(píng)分的影響肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)：將左肺常規(guī)切片4μm HE染色，進(jìn)行光鏡下觀察肺組織病理改變。Szapiel 評(píng)分方法判定肺泡炎和肺纖維化程度[10]。肺泡炎分級(jí)：0級(jí)示正常肺泡形態(tài)，計(jì)1分；Ⅰ級(jí)示輕度肺泡炎，計(jì)2分；Ⅱ級(jí)示中度肺泡炎，計(jì)3分；Ⅲ級(jí)示重度肺泡炎，計(jì)4分。肺纖維化分級(jí)：0級(jí)示正常肺組織，無(wú)纖維化；Ⅰ級(jí)示輕度纖維化，受累面積<20%，纖維化累及胸膜、胸膜下肺間質(zhì)，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂；Ⅱ級(jí)示中度纖維化，病變范圍約占全肺 20%～50%，肺纖維化區(qū)域從胸膜開(kāi)始延伸，但仍屬局部性；Ⅲ級(jí)示重度纖維化，病變范圍>50%，并有融合，可見(jiàn)大小不等的囊氣腔，并伴有廣泛肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。

1.5 小鼠肺組織NF-κB p65 mRNA水平的測(cè)定用TRIzol(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)提取總RNA提取RNA。QuantiTest SYBR Green RT-PCR Kit(Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan)用于通過(guò)一步qRT-PCR測(cè)試基因表達(dá)。20 μL qRT-PCR體系為：10 μL 2×QuantiTect SYBR Green RTPCR Master Mix、1.0 μL正向和反向引物(0.5 μm/L)、2 μg模板RNA、0.5 μL QuantiTectRT Mix和ddH2O。引物序列為：NF-κB p65正向，5′-GTCCATCTT CCAGTACAGTGTTG-3′，反向，5′-AGCCATCTTTACCAGACAGTGT-3′;GAPDH正向，5′-GTGGACCTGACCTGCGTCT-3′和反向，5′-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′。PCR條件為：95℃預(yù)變性15 min，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含94℃變性15 s，60℃退火30 s和72℃延伸30 s。在ABI ViiATM 7熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)儀上檢查基因表達(dá)。使用2-ΔΔCt方法檢測(cè)NF-Kbp65 mRNA水平。GAPDH mRNA水平用于檢測(cè)mRNA水平的標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 小鼠肺組織NF-Kbp65 蛋白水平的測(cè)定將10 mg肺組織用蛋白質(zhì)裂解緩沖液(Pierce; Thermo Fisher Scientific，Inc)裂解。溫育20 min后，將組織裂解物離心后，用二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc。)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)10%SDS-PAGE分離總共50μg等份的裂解物并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.05%Tween 20的Tris緩沖鹽水(pH7.4)中的5%干燥脫脂乳封閉膜。根據(jù)制造商的方案，依次與初級(jí)(稀釋?zhuān)?∶200)和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)(稀釋?zhuān)?∶5 000)抗體一起溫育。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡底物(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)和Chemidoc XRS凝膠文獻(xiàn)系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules，CA，USA)使目的蛋白質(zhì)可視化。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(Elisa)大鼠肺組織中HYP、IL-4、TNF-α蛋白水平稱(chēng)取大鼠肺組織，制成勻漿，收集上清液，檢測(cè)HYP、IL-4、TNF-α蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)小鼠肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別評(píng)分的影響與對(duì)照組比較，模型組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，強(qiáng)的松組、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)降低(P<0.05)，且隨著加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的增加，肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別逐漸降低(P<0.05)；與強(qiáng)的松組相比，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)升高(P<0.05)；高劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)各組小鼠肺纖維化的影響對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常；模型組肺泡腔可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膠原纖維滲出；強(qiáng)的松組及加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，膠原纖維滲出減少；加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)仍明顯，膠原纖維滲出較對(duì)照組略微減少,見(jiàn)圖1。

表1 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)小鼠肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別評(píng)分的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，&P<0.05； 與強(qiáng)的松組比較，#P<0.05； 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組比較，☆P<0.05； 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組比較，△P<0.05。

A： 對(duì)照組

B： 模型組

C： 強(qiáng)的松組

D： 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組

E: 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組

F: 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組

圖1 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)各組小鼠肺纖維化的影響(HE ×400)

2.3 各組小鼠肺組織NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，模型組肺組織NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，強(qiáng)的松組、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組肺組織NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，且隨著加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的增加，肺組織NF-ΚBp65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)；與強(qiáng)的松組相比，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組肺組織NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；高劑量組肺組織NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組小鼠肺組織NF-ΚBP65 mRNA、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05； 與強(qiáng)的松組比較，&P<0.05； 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組比較，☆P<0.05; 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組比較,△P<0.05。

注：A，對(duì)照組；B，模型組；C，強(qiáng)的松組；D，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組；E，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組； F，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組。

圖2 加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)小鼠肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 各組小鼠肺組織HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且隨著加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的增加，HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)；與強(qiáng)的松組相比，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；高劑量組HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)略微升高(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織HYP、IL-4、TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，&P<0.05； 與強(qiáng)的松組比較，#P<0.05； 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組比較，☆P<0.05; 與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組比較,△P<0.05。

3 討論

一般認(rèn)為肺痿是最恰當(dāng)?shù)姆卫w維化的中醫(yī)病名，肺痿是肺部反復(fù)感染，燥熱熏灼，邪氣稽留，宣肅不徹，久咳傷肺，漸生痰濁等病理產(chǎn)物瘀阻于肺或其他疾病誤治之后重傷津液，導(dǎo)致肺失濡潤(rùn)而成。外邪入侵人體，留滯肺內(nèi)，損害肺臟，造成肺氣虧虛，令氣失所主，肺為氣之主，腎為氣之根，肺病虛損，病久及腎，則腎氣虛弱，不能納氣歸元，氣浮逆于上，則為喘促，動(dòng)則尤甚。加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有益氣補(bǔ)肺、活血祛瘀的功效。已有研究表明，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯減弱了CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)拮抗氧化應(yīng)激，抑制人肺成纖維細(xì)胞中的遷移，增殖和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并減弱肺泡上皮中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而干擾肺纖維化[11]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別明顯升高；與模型組比較，強(qiáng)的松組、加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)降低，且隨著加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的增加，肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)別逐漸降低；與強(qiáng)的松組相比，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)升高；高劑量組肺泡炎級(jí)別、肺纖維化級(jí)無(wú)明顯變化。這說(shuō)明，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯抑制小鼠肺纖維化程度，其高劑量效果與強(qiáng)的松相似，而本研究的病理結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。

在肺損傷期間，NF-κB被炎性細(xì)胞和活性氧物質(zhì)持續(xù)激活，刺激細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的增殖[12-13]。因此，NF-κB在肺纖維化的發(fā)展和進(jìn)展中是重要的。NF-κB是由Rel蛋白家族的p65和p50亞基組成的轉(zhuǎn)錄因子，但只有p65有激活基因轉(zhuǎn)錄的功能[14]。正常情況下，NF-κB與其抑制劑結(jié)合，以無(wú)活性狀態(tài)存在于巨噬細(xì)胞、氣管和肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)，不發(fā)生作用[15]。在肺纖維化過(guò)程中，細(xì)胞受到各種炎性刺激，細(xì)胞內(nèi)核因子κB抑制劑被降解，核因子-κB釋放激活并發(fā)生作用，使受其調(diào)控的肺泡巨噬細(xì)胞、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、血管緊張素(AngⅡ)、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞因子基因表達(dá)增加，導(dǎo)致其過(guò)度增生和增多，最終導(dǎo)致了肺纖維化[16-18]。本研究顯示，模型組肺NF-κB p65的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明，博萊霉素激活肺組織分泌NF-κB p65。給予加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯后，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組的NF-κB p65表達(dá)的降低。這些結(jié)果表明，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯的抗炎和抗纖維化作用是由于降低NF-κB p65表達(dá)，發(fā)揮了肺泡巨噬細(xì)胞、AngⅡ、成纖維細(xì)胞等抑制成纖維細(xì)胞增殖的作用。

本研究同時(shí)探討了加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)NF-κB p65下游炎癥因子IL-4、TNF-α及纖維因子HYP的影響，結(jié)果提示與模型組比較，加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低，且隨著加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的增加，HYP、IL-4、TNF-α蛋白表達(dá)逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。這說(shuō)明加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以抑制博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，其機(jī)制與加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯抑制NF-κB p65活化，繼而抑制炎癥因子及纖維因子的表達(dá)有關(guān)。