基于Cell-SELEX的核酸適配體在腫瘤診治中的應(yīng)用

田彩平 廖世奇 孫敬陽 王維君 許金苓 楊碎勝

惡性腫瘤已經(jīng)成為世界性的健康問題之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，到2025年惡性腫瘤病例將從2012年的1 400 萬增加到2 000 多萬［1］。惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有很多的誘導(dǎo)因素，比如病毒感染、環(huán)境因素和基因異常等等，這些因素導(dǎo)致惡性腫瘤的復(fù)雜性［2］。惡性腫瘤與基因組之間有著密切的聯(lián)系，特異性表型與個體基因型的相關(guān)性是腫瘤（腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤）研究的關(guān)鍵，惡性腫瘤發(fā)生的過程主要是由原癌基因的損傷或突變引起的，這些基因編碼了與細胞增殖、分化有關(guān)的蛋白質(zhì)，以及與生長和凋亡有關(guān)的信號［3］。蛋白質(zhì)是關(guān)于細胞內(nèi)發(fā)生變化的更準(zhǔn)確的信息來源，是疾病本身發(fā)展的一個關(guān)鍵指標(biāo)，它可以在體液或組織中被檢測到，所以蛋白質(zhì)可以成為疾病檢測的生物標(biāo)記。惡性腫瘤細胞和正常細胞表面有不同的受體蛋白，利用這些受體可以判斷疾病進展以及預(yù)后。Tuerk 等［4］構(gòu)建了指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，Tan 等［5］構(gòu)建了Cell-SELEX 技術(shù)，它是以整個細胞作為靶標(biāo)篩選特異性核酸適配體的技術(shù)，并且不需要預(yù)先了解細胞表面蛋白種類及其表達水平，特別適用于腫瘤細胞的核酸適配體篩選，為藥物篩選、臨床診斷、疾病治療和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究等帶來了新的思路和方法，在腫瘤診治領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文對基于Cell-SELEX的核酸適配體在腫瘤診治中的應(yīng)用做一綜述，以期為Cell-SELEX 的研究提供參考依據(jù)，對惡性腫瘤的分子診斷、個體化治療研究提供幫助。

1 SELEX 技術(shù)

SELEX 技術(shù)是一種新的組合化學(xué)技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用體外化學(xué)合成的大容量隨機寡核苷酸文庫（ss-DNA 文庫和RNA 文庫）與靶物質(zhì)結(jié)合，洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的DNA，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的DNA，以此DNA 為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增，進行下一輪的篩選過程。通過重復(fù)的篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA 或RNA分子被洗去，而與靶物質(zhì)有高親和力的DNA 或RNA 從隨機文庫中分離出來，即核酸適配體［6］。

人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫包括DNA文庫、RNA 文庫、修飾化的RNA 文庫，該文庫是兩端約為20 個堿基的固定序列（該區(qū)域帶有限制性內(nèi)切酶位點，是多聚酶鏈反應(yīng)及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點），中間為約20～40 個堿基的隨機序列，庫容量可達1015，理論上，庫容量達到1014以上的隨機寡核苷酸文庫幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，可為自然界存在的所有分子“配型”，識別特異性的核酸配體［7］。單鏈寡核苷酸因序列不同，可形成構(gòu)象不同且熱力學(xué)上穩(wěn)定的二級和三級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡、口袋、假結(jié)、G 四聚體等，由于隨機序列的存在，文庫中的單鏈寡核苷酸因序列各異而形成多樣而獨特的空間構(gòu)象，適配體能夠通過堿基配對、范德華力，氫鍵和靜電等相互作用和靶標(biāo)結(jié)合，主要是特異性莖環(huán)識別靶標(biāo)［8］（見圖1A 至C），然后結(jié)合PCR 體外擴增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過反復(fù)的體外篩選、擴增，最終獲得高親和力、高特異性的核酸適配體［9］。

應(yīng)用SELEX 技術(shù)篩選的靶物質(zhì)范圍廣泛，包括DNA聚合酶、人免疫缺陷病毒反轉(zhuǎn)錄酶（human immunodeficiency virus reverse transcriptase 1，HIV-1）、細胞生長因子、激素、小肽、抗體以及三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）、氨基酸等小分子有機物，甚至金屬離子、糖、有機染料，以及完整的細胞、病毒、孢子等［10］。該技術(shù)和抗體相比具有操作簡便，篩選周期短等優(yōu)點，更為重要的是它與靶細胞或靶分子的高特異性和高親和性［11］（見表1）。經(jīng)過多年的研究，SELEX技術(shù)篩選的適配體在疾病診斷、治療、藥物遞送、生物成像、分析試劑、法醫(yī)鑒定、危險性檢測、食品應(yīng)用、搜索工具等多個方面得到應(yīng)用［12］。

2 Cell-SELEX 技術(shù)

盡管應(yīng)用傳統(tǒng)SELEX 技術(shù)已經(jīng)篩選到許多高特異性的適配體，但生物體內(nèi)在生理條件下可能發(fā)生翻譯后修飾或三維構(gòu)象的改變，使得篩選到的適配體無法識別該靶標(biāo)在細胞膜表面的天然構(gòu)象。細胞作為與外界環(huán)境交換物質(zhì)和能量的結(jié)構(gòu)，細胞表面膜上存在大量的蛋白質(zhì)類功能分子，占細胞蛋白總量的30%，這些蛋白質(zhì)類功能分子能夠維持細胞結(jié)構(gòu)的完整性，并且對細胞生理功能起著關(guān)鍵作用［13］。如離子通道與胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能有關(guān)，受體與細胞辨認和接受環(huán)境中特異的化學(xué)性刺激有關(guān)，白細胞分化抗原（Cluster of Differentiation，CD）分子與細胞的免疫功能有關(guān)［14］。因此，為了篩選出能夠識別膜蛋白天然構(gòu)象的適配體，Tan 等［5］率先提出了Cell-SELEX 技術(shù)，與傳統(tǒng)SELEX 技術(shù)不同的是，Cell-SELEX 的靶標(biāo)是完整的活細胞，篩選出細胞表面分子的適配體，該技術(shù)最大的優(yōu)點是在篩選過程中能夠同時以多種呈天然構(gòu)象的膜蛋白為靶標(biāo)分子，并且不需要預(yù)先了解細胞表面蛋白種類及其表達水平。惡性腫瘤的發(fā)生是由于基因的突變，這些突變的基因會引起細胞內(nèi)部分子的改變，最終引起細胞形態(tài)和生理的改變。研究表明膜蛋白的種類及其表達水平均與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而Cell-SELEX 技術(shù)對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制的研究、惡性腫瘤新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及惡性腫瘤精準(zhǔn)診療新方法的提出具有一定的促進作用，在惡性腫瘤的檢測診療及生物標(biāo)志物的研究方面具有良好的前景。

圖1 適配體的結(jié)構(gòu)和與它特異性結(jié)合的靶標(biāo)示意圖Figure 1 Depiction of the aptamer structure and its interaction with the target

表1 核酸適配體和蛋白質(zhì)抗體特性對比Table 1 The characteristics comparison of nucleic acid aptamers and protein antibody

Cell-SELEX 篩選過程主要包括孵育、洗脫和擴增3 個過程。為了提高所篩選的核酸適配體的特異性，文庫先與形態(tài)上、生物學(xué)上以及生物化學(xué)上相似的反篩靶細胞（一般以正常細胞作為反篩靶細胞）結(jié)合，然后再與正篩靶細胞（一般以腫瘤細胞作為正篩靶細胞）結(jié)合，然后洗脫掉沒有與靶蛋白結(jié)合的核酸分子，具有強結(jié)合力的核酸適配體通過PCR 技術(shù)擴增分離得到，然后被用作下一輪篩選的次級文庫，這個過程重復(fù)幾個循環(huán)，直到篩選到高親和力和高特異性的適配體為止，最后，通過克隆測序，測定篩選得到的適配體分子的詳細序列信息。

3 篩選的核酸適配體在腫瘤診治中的應(yīng)用

應(yīng)用Cell-SELEX 技術(shù)篩選到了許多針對細菌細胞、大腸桿菌、被狂犬病病毒感染的幼鼠細胞系（BHK-21）的核酸適配體，更重要的是篩選到很多針對不同惡性腫瘤細胞類型的核酸適配體，比如針對肺癌、惡性膠質(zhì)瘤、胰腺、結(jié)腸直腸癌、肝癌、淋巴瘤、白血病以及其它惡性腫瘤的核酸適配體。這些適配體的成功篩選對惡性腫瘤生物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、診斷、治療、分子成像、藥物遞送都已有應(yīng)用［15-16］。如從惡性膠質(zhì)瘤K308 細胞篩選的WQY-9-B 適配體用于診斷分子探針，從卵巢癌Caov-3 細胞篩選的RLA01、RLA02 和RLA03 適配體用于診斷和藥物遞送，從乳腺癌MCF-7細胞篩選的MS03適配體用于診斷和治療，從胰腺導(dǎo)管腺癌PL45 細胞系篩選的XQ-2d 適配體用于體內(nèi)成像和臨床組織識別（見表2）。

表2 應(yīng)用Cell-SELEX 篩選出的核酸適配體Table 2 The nucleic acid aptamers screened by cell-SELEX

3.1 在腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用

通過Cell-SELEX 篩選的核酸適體可以特異性識別腫瘤細胞，其識別的基礎(chǔ)是腫瘤細胞與正常細胞之間存在的未知膜蛋白的分子差異。因此，分離鑒定能夠與腫瘤細胞特異性識別的核酸適配體結(jié)合的靶蛋白就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物。Shangguan 等［33］利用Cell-SELEX 技術(shù)成功的發(fā)現(xiàn)了對于T 細胞急性淋巴白血病的潛在腫瘤標(biāo)志物酪氨酸蛋白激酶受體分子（protein tyrosine kinase 7，PTK7）。Jia 等［24］利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)CD109 有可能成為對鼻咽癌進行早期診斷和治療的一個新的腫瘤標(biāo)志物。Kaur 等［34］用該技術(shù)篩選出的能夠抑制腫瘤細胞侵襲的核酸適體TOV6，通過siRNA（小干擾RNA）沉默等技術(shù)，確定出了卵巢癌的潛在腫瘤標(biāo)志物磷酸化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白（stress-induced phosphoprotein 1，STIP1）等。

3.2 在腫瘤靶向治療方面的應(yīng)用

藥物對腫瘤治療效果不理想的原因大多數(shù)是藥物對腫瘤細胞的選擇性差、毒性大以及易產(chǎn)生耐藥性等，由于核酸適體對靶細胞有高親和性和特異性，所以在腫瘤的靶向治療中具有重要意義。Meng 等［35］將抗癌藥物DOX 與人肝腫瘤細胞株LH86 的核酸適配體TLS11a-GC 偶連形成藥物-適配體共軛探針，實驗結(jié)果表明DOX-TLS11a-GC對靶細胞具有靶向性與特異性，因此該核酸適配體可以用于抗癌藥物的靶向遞送。Liu 等［36］將抗癌藥物DOX 包裹于納米顆粒中，再與適配體結(jié)合組裝成三維納米結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明DOX 能有效穩(wěn)定地插入到適配體中，這樣改裝的DOX 對人乳腺癌細胞的耐藥性具有抑制作用。Zhu 等［37］研究發(fā)現(xiàn)用核酸適配體作為火車頭識別靶細胞，由DNA 組裝的車廂用來載藥，以此達到靶向治療的目的。此外，適配體結(jié)合其他材料應(yīng)用于腫瘤靶向治療的研究還有很多，相信其可以作為藥物載體在腫瘤診治中發(fā)揮重要作用。

3.3 在循環(huán)腫瘤細胞檢測方面的應(yīng)用

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）能夠?qū)崟r反應(yīng)腫瘤動態(tài)，對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移監(jiān)測以及預(yù)后評估都有重要價值，但由于其在癌癥患者外周血液中含量少，很難被檢測到。由于Cell-SELEX 篩選出的核酸適體具有優(yōu)越的細胞特異性和親和性，結(jié)合微流控技術(shù)，為CTCs 的檢測提供了新的方法。方曉紅等［38］利用Cell-SELEX 篩選到了與非小細胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）特異性結(jié)合的核酸適體，然后對其進行修飾使之與硅納米微流芯片結(jié)合，檢測到晚期肺小細胞肺癌患者外周血中的CTCs。Xu 等［39］設(shè)計了一種能夠高效、高選擇性并簡便的捕獲CTCs 的微流體系統(tǒng)。當(dāng)細胞混合物通過該微流體系統(tǒng)時，能夠捕獲不同類型的白血病細胞。方帥［40］采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCNP 和sgc8 結(jié)合來檢測CTCs 中人急性淋巴白血病細胞（human acute lymphatic leukemia cells，CCRF-CEM），并將檢測得到的CTCs 細胞利用超順磁磁性納米材料進行有效的分離，此外，他們還模擬了臨床樣本，即使靶細胞數(shù)量極少時，其檢測模型也能夠進行高效率的捕獲、富集和分離。

3.4 作為藥物方面的應(yīng)用

核酸適配體可以直接作為藥物來治療腫瘤，其原理是作為藥物分子結(jié)合腫瘤細胞中的相關(guān)代謝分子來影響細胞調(diào)節(jié)途徑，例如阻遏信號傳導(dǎo)、血管生成以及免疫功能等，從而進行細胞殺傷或調(diào)控凋亡，阻止腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。由Eyetech 與輝瑞公司聯(lián)合生產(chǎn)的核酸適配體藥物Macugen［41］作為一種抗血管內(nèi)皮生長因子的RNA 適配體，能有效治療年齡相關(guān)性黃斑病變，也在2004年被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市，Macugen 的上市為適配體藥物研究帶來了曙光。Lee 等［42］研究發(fā)現(xiàn)骨膜蛋白的適配體PNDA-3 能破壞骨膜蛋白與其細胞表面受體的相互作用，從而抑制骨膜蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的黏附與轉(zhuǎn)移，可用于抑制乳腺癌的擴增與轉(zhuǎn)移的潛在藥物。目前有數(shù)百種的核酸適配體藥物進行臨床驗證，相信隨著技術(shù)的發(fā)展，核酸適配體藥物將會展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

由于核酸適配體具有分子量小、設(shè)計靈活、易于修飾等優(yōu)點，在臨床診斷和疾病治療中表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景，Cell-SELEX 與靶細胞膜蛋白高特異性、高親和性的結(jié)合，能較好地區(qū)分不同細胞之間的膜蛋白差異，是用于惡性腫瘤檢測的理想工具。應(yīng)用Cell-SELEX 技術(shù)篩選的適配體在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等惡性腫瘤的診斷治療中已有應(yīng)用，但是核酸適配體廣泛應(yīng)用于臨床還需克服一定的困難。首先，Cell-SELEX 適配體篩選結(jié)果與核苷酸適配體的類型、長度、堿基組成和修飾有關(guān)系，還與靶標(biāo)蛋白的離子強度、緩沖試劑成分、溫度、pH 值等也有關(guān)系，此外還與洗脫時間、洗脫次數(shù)、文庫純度、文庫濃度與靶蛋白的比率等都有關(guān)系，因此限制了在和臨床與藥物開發(fā)等方面的應(yīng)用。盡管存在制約因素，但是相信隨著研究的不斷深入，這些難題將會被攻克，Cell-SELEX 技術(shù)篩選的核酸適配體在腫瘤的臨床診治中將有可能得到廣泛應(yīng)用。