蘇曉菱 李麗鎣 李苗苗 何潔 王瑞雪 王勇.2★ 羅樹紅★

抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）作為女性卵巢儲(chǔ)備功能的評(píng)價(jià)以及輔助生殖技術(shù)中卵巢反應(yīng)性評(píng)估的激素，是由睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌。與其他臨床常用卵巢功能的生物學(xué)指標(biāo)相比AMH 濃度相對(duì)穩(wěn)定［1］。隨著國(guó)內(nèi)“二孩”政策的開放，評(píng)估高齡女性卵巢儲(chǔ)備功能成為了輔助生殖技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)［2］。研究表明抗苗勒管激素是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的穩(wěn)定指標(biāo)，不受月經(jīng)周期、口服避孕藥、促性腺激素釋放激素的影響，是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能最直接、準(zhǔn)確的指標(biāo)。血清AMH 的水平與年齡呈負(fù)相關(guān)。其水平低于相應(yīng)年齡段正常參考范圍，則可認(rèn)為卵巢早衰。高水平的AMH 為多囊卵巢綜合癥的診斷提供依據(jù)［3-5］。將純化后的原核表達(dá)的AMH 蛋白作為抗原免疫小鼠。將抗AMH 蛋白單克隆抗體應(yīng)用到評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力的診斷中。現(xiàn)今已發(fā)展到全自動(dòng)AMH 檢測(cè)技術(shù)［6-7］，簡(jiǎn)化了繁瑣的操作步驟。本抗體對(duì)有望替代進(jìn)口AMH 抗體，降低AMH 診斷試盒的成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

AMH 重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備；BALB/c 小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并培養(yǎng)。

1.2 試劑

HAT/ HT 選擇性培養(yǎng)基及添加劑、福氏佐劑、細(xì)胞融合劑PEG1450 均購自美國(guó)Sigma 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自上海生工生物工程；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基均購自中國(guó)GIBCO 公司；Protein G 親和層析柱和NI-NTA 親和層析柱購自GE 醫(yī)療中國(guó)；BCA（Bicinchoninic acid, BCA )蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司（Beyotime Biotechnology）。

1.3 AMH 蛋白的制備與純化

選取合適的AMH 基因，優(yōu)化使其適合于大腸桿菌中表達(dá)。構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，利用化學(xué)誘導(dǎo)法使大腸桿菌成為感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將穿刺菌至于含卡那霉素（Kan）的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12～16 h，取菌液于含Kan 的LB（Luria-Bertani）細(xì)菌培養(yǎng)基上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。挑選出平板中淡黃色菌落，內(nèi)含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，至于含抗性LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6 h。完成后菌液分成兩份，分別用于制備菌種和PCR 擴(kuò)增和電泳分析。經(jīng)PRC 鑒定和測(cè)序正確的菌液加入甘油，然后添加甘油并保存在-80℃。

取甘油菌至LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，37℃，220 rmp 振搖，至OD=0.6，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-b-D-thiogalactoside，IPTG)，至終濃度梯度為0.5 mM。取500 μL 菌液作為負(fù)對(duì)照，IPTG 37℃下誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收取菌體，經(jīng)破碎、離心處理后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)AMH 重組蛋白的表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件后，進(jìn)行AMH 蛋白大量表達(dá)，并對(duì)可溶性蛋白通過NI-NTA 親和層析柱（GE）純化，純化的物質(zhì)通過SDS-PAGE 電泳，并用考馬斯藍(lán)染色以評(píng)估其分子量，BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定AMH 蛋白的濃度。

1.4 動(dòng)物免疫

以純化后的AMH 重組蛋白為免疫原，首次AMH 重組蛋白與等體積的福氏佐劑充分乳化，分別50 μg，以100 μg/只的量于BALB/c 小鼠背部皮下多點(diǎn)注射免疫。二次、三次免疫同樣使用50 μg AMH 重組蛋白與等量不完全福氏佐劑。每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，在三次免疫的一周后，采血、分離血清進(jìn)行間接ELISA 以檢測(cè)小鼠體內(nèi)抗AMH 蛋白抗體的效價(jià)。選免疫效價(jià)高的免疫小鼠取脾，準(zhǔn)備骨髓瘤-脾細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的篩選具體實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)見參考文獻(xiàn)［8］。經(jīng)過3 次亞克隆后，即得到能穩(wěn)定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)于液氮保存。

1.6 單克隆抗體的制備［9］

單克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)具體步驟請(qǐng)見參考文獻(xiàn)［9］。采用8～10 周齡的BALB/c 小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，抽取腹水后離心，Protein G 親和純化得到單克隆抗體。

1.7 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

使用ELISA 間接法［10］：①包被：將重組抗原以1 μg/mL，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，置于4℃孵育過夜；封閉：用PBST 洗凈ELISA 板，加入200 μL/孔5%的脫脂奶粉，于37℃封閉2 h，以占據(jù)固相中未被重組抗原包被的位點(diǎn)，減少非特異性反應(yīng)；③反應(yīng)：洗板后，加入倍比稀釋濃度的抗體（分別為500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8、0.0 ng/mL），100 uL/孔，置于37℃孵育1 h；④加入二抗：洗板后，加入適當(dāng)稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，置于37℃孵育1 h；⑤顯色：加入TMB 顯色底物100 μL/孔，反應(yīng)10 min；⑥終止：加入50 μL 2 mol/L 硫酸終止液終止反應(yīng)；⑦讀數(shù)：酶標(biāo)儀于450 nm 處，讀取各孔OD 值。

1.8 單克隆抗體的亞型鑒定

應(yīng)用小鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑條對(duì)抗體的亞型進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)使用說明書操作，將70 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清加到試劑條的加樣區(qū)，10 min 后，與參照卡比對(duì)，確定抗體亞型。

2 結(jié)果

2.1 AMH 重組蛋白的小量表達(dá)與純化

經(jīng)過37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h 和25℃誘導(dǎo)表達(dá)過液，菌體收集破碎，SDS-PAGE 分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，AMH蛋白主要在包涵體中表達(dá)。37℃條件下，表達(dá)量更高且更省時(shí)，所以以37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，進(jìn)行大量表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE 膠分析，NI-NTA 親和層析柱純化后的AMH 蛋白純度達(dá)85%以上，蛋白分子量大約40 k 左右。見圖2。

圖1 AMH 蛋白小量表達(dá)Figure 1 Small amount of AMH protein expression

圖2 SDS-PAGE 分析AMH 純化蛋白Figure 2 The purified AMH protein demonstrated with SDS-PAGE

2.2 小鼠免疫效價(jià)測(cè)定

純化的AMH 重組蛋白混合福氏佐劑用作免疫原，通過多次皮下注射使小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。免疫3 次后，小鼠取血進(jìn)行抗體效價(jià)評(píng)估。在1∶128 000 處的OD 值超過陰性對(duì)照的OD 值的2.1 倍，而1∶256 000 時(shí)，OD 值小于陰性對(duì)照OD 值的2.1 倍，為陰性結(jié)果。見圖3。

圖3 小鼠血清免疫效價(jià)Figure 3 Analysis of the immunopotency of mouse serum

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

于96 孔ELISA 板中選取陽性孔，經(jīng)有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行克隆化，3 次亞克隆后，即得到能穩(wěn)定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，得到2 株雜交瘤細(xì)胞，孔內(nèi)上清抗體檢測(cè)為陽性。將2 株能穩(wěn)定分泌特異性抗AMH 蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3F6、4E7。

2.4 單克隆抗體的純化

經(jīng)Protein G 親和層析法純化后的單克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，圖4 中可見55 kD、25 kD 兩條清晰的條帶，其中位于55 kD 的為抗AMH 重組蛋白抗體的重鏈，25 kD 為其輕鏈。

2.5 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定、亞型鑒定

無菌抽取小鼠腹水，使用間接ELISA 法于450 nm 處定量檢測(cè)腹水中抗體效價(jià)為6.25 ng/mL，見圖5。使用亞型檢測(cè)試紙條，可直觀得出2 株單克隆抗體均為IgG1 型，見圖6。

圖4 單克隆抗體分析Figure 4 The analysis of monoclonal antibody with SDS-PAGE

圖5 單克隆抗體的效價(jià)Figure 5 Concentration of 3F6 and 4E7 antibody

圖6 抗體亞型鑒定Figure 6 The subtype identification of antibody

3 討論

利用大腸桿菌作為原核表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，可構(gòu)建出AMH 基因的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)出AMH 蛋白。大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在此溫度下易生成包涵體蛋白。同時(shí)，包涵體的形成是目的蛋白表達(dá)量很高的表現(xiàn)。本項(xiàng)目采取降低IPTG 濃度并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間的方法獲得更多可溶蛋白。動(dòng)物免疫制備單克隆抗體的過程中，若AMH 蛋白不純會(huì)影響抗體的產(chǎn)生。采取多次多點(diǎn)注射以提高小鼠血清的免疫效價(jià)。經(jīng)過3 次免疫的小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)達(dá)1∶128 000。可認(rèn)為此時(shí)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗AMH 重組蛋白的抗體的能力較為活躍，制備脾細(xì)胞懸液。于小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞前，注入降植烷可加速瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究經(jīng)對(duì)重組AMH 蛋白雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行3 次亞克隆，成功制備出2 株抗苗勒管激素單克隆抗體，并進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定和亞型的鑒定。方法步驟較繁瑣，而且鼠源性的單克隆抗體有一定的應(yīng)用局限性［9］?？捎行路f、可行的方法供純化單克隆抗體的應(yīng)用［11］。血清中AMH 作為卵巢儲(chǔ)備功能的血清標(biāo)志物，具有預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備、妊娠結(jié)局的功能［12-14］，高水平AMH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞瘤的診斷有重要的意義［15］。同時(shí)，AMH 水平的高低比年齡更能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)婦女的更年期［16］。制備出的抗苗勒管激素單克隆抗體可用于血清AMH 的定量檢測(cè)，采用的檢測(cè)原理為雙抗體夾心法，將其應(yīng)用于全自動(dòng)免疫分析儀的試劑中。AMH 測(cè)量的可靠性和可重復(fù)性引起了許多疑問，自2014年以來，已經(jīng)開發(fā)出自動(dòng)加樣提高AMH 測(cè)量的靈敏度和可重復(fù)性。自動(dòng)化方法的準(zhǔn)確度提高了四倍，速度更快需要的血清量更少［1］。但要注意用于檢測(cè)的AMH 免疫測(cè)定法并未使用相同的抗體對(duì)，因此仍然有必要定義特定的參考值和臨界點(diǎn)［6］，對(duì)檢測(cè)結(jié)果解釋不能一概而論。依據(jù)現(xiàn)今科技發(fā)生的速度，預(yù)測(cè)在不久將來，可將其應(yīng)用于免疫層析試紙條的檢測(cè)AMH。在這醫(yī)學(xué)技術(shù)日益發(fā)展的今天，深入探究更多檢測(cè)試劑核心原料的作用與來源，可通過現(xiàn)今技術(shù)，進(jìn)行改良與優(yōu)化，有利于推動(dòng)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，惠及更多人群。