龍勝文，尹梓豪，許斐鈺，丁小鳳

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長沙 410081)

乳腺癌是世界上最常見的癌癥之一[1]。據(jù)估計(jì)，2014年美國有40 430名女性患者死于乳腺癌[2]。盡管在乳腺癌治療方面取得了一定的突破，但目前估計(jì)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌在5年內(nèi)的生存率低于25%，10年內(nèi)的生存率為5%～10%[3]。手術(shù)和化療是治療乳腺癌的主要兩種方式,而腫瘤細(xì)胞的耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。因此，進(jìn)一步探索乳腺癌治療耐藥的新機(jī)制對(duì)于了解乳腺癌的發(fā)展和設(shè)計(jì)治療靶標(biāo)至關(guān)重要。

在轉(zhuǎn)錄過程中存在不同的修飾而6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物中mRNAs[4],microRNAs[5],longnon-coding RNAs[6]最豐富的內(nèi)部化學(xué)修飾。RNA的m6A修飾主要發(fā)生在3′UTR[7,8]和5′UTR[9]，與RNA的轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯以及代謝過程有關(guān)。m6A的修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)控過程，主要涉及三類調(diào)控蛋白，包括甲基轉(zhuǎn)移酶(METLL3,METTL14,WTAP,KIAA1429)[10-15]，去甲基化酶(FTO,ALKBH5)[16-18]和讀取蛋白(YTHDF1/2/3,YTHDC1/2,IGF2BP11/2/3,eIF3)[9,19-25]。最近研究表明m6A相關(guān)蛋白參與了不同類型癌癥的發(fā)生、發(fā)展，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、急性髓性白血病、肝細(xì)胞癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌和乳腺癌[26-31]以及癌癥治療耐藥發(fā)展的過程，如胰腺癌、白血病、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[29,32-34]。然而，作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶組合的關(guān)鍵組分，Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein,WTAP)在乳腺癌治療耐藥中的功能作用暫無報(bào)道，本次研究在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)WTAP，耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞中敲低WTAP的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞遷移的影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自中科院上海細(xì)胞庫。MCF-7/ADR細(xì)胞系購自上海酶研生物科技有限公司。質(zhì)粒構(gòu)建的pCMV-Myc載體購自Clone-tech公司。siRNA購自蘇州吉瑪基因公司。RNA Trizol提取試劑和SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自Takara公司。用于內(nèi)參檢測(cè)的GAPDH抗體購自Sigma公司。Myc-Tag抗體購自武漢三鷹公司。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin和Snail抗體購自ABclonal公司。WTAP抗體購自Abcam公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度恒溫箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期用于試驗(yàn)。MCF-7/ADR細(xì)胞培養(yǎng)于500 ng/mL Adriamycin(ADR)中，在正式試驗(yàn)前撤藥培養(yǎng)2周。

1.2.2 MTT法檢測(cè)阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔6×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，每孔加100 μL的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后，每孔補(bǔ)加不同濃度的阿霉素使其終濃度分別為0、10、20、40、80、160、320、640 μmol/L。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)5個(gè)平行孔。藥物處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL的MTT液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去MTT液，每孔加入120 μL的DMSO并避光輕搖15 min。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長處吸光度值。

1.2.3 熒光定量PCR

首先用Trizol法提取RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR GreenqPCR試劑盒步驟檢測(cè)ythdf2、mettl3、mettl14、wtap和fto的表達(dá)，所用的引物見表1。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 The name and sequences of primers

1.2.4pCMV-Myc-wtap重組載體的構(gòu)建

以從MCF-7細(xì)胞中抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為模板，以wtapF:5′-GAATCATGACCAACGAA GAACCTCTTC-3′和wtapR:5′-GGTACCTGTACAGGGT TCAGTTTTGTAA-3′(在5′端引入了EcoRI的酶切位點(diǎn)，在3′端引入了KpnI的酶切位點(diǎn)，下劃線序列為酶切位點(diǎn))為引物，應(yīng)用KOD FX DNA聚合酶(Toyobo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃變性5 min，然后98 ℃15 s，64 ℃20 s，68 ℃60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。獲得wtap完整的編碼序列。連入真核生物表達(dá)載體pCMV-Myc中，EcoRI和KpnI雙酶切驗(yàn)證后，測(cè)序確認(rèn)序列的正確性。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，在過表達(dá)WTAP的孔板中每孔接種4×105個(gè)細(xì)胞，用于干擾WTAP表達(dá)的孔板中每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至24 h，按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書操作，將脂質(zhì)體與pCMV-Myc、pCMV-Myc-wtap質(zhì)?；騈C siRNA、wtapsiRNA分別經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)基均勻混合后，分別加至細(xì)胞中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.6 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

按1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟將干擾和過表達(dá)WTAP的細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h。消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。在下室加入700 μL含20%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL的細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)36 h，MCF-7/ADR細(xì)胞培養(yǎng)24 h，取出小室，吸干上室液體，用甲醇室溫固定30 min。移除固定液，用結(jié)晶紫室溫染色30 min，用清水浸泡數(shù)次，取出小室，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞。拍照，統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)WTAP、Snail、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

按1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟將干擾和過表達(dá)WTAP的細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h。用胰酶消化收集細(xì)胞，加RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上放置30 min，抽提細(xì)胞全蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入抗WTAP抗體、Snail抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體和N-cadherin抗體。4 ℃孵育過夜。次日，加HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL化學(xué)發(fā)光底物，在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 WTAP在MCF-7/ADR細(xì)胞中高表達(dá)

我們首先用MTT法檢測(cè)阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞活力的抑制。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞活力都有不同程度的抑制作用，且對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用大于對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的抑制作用，如圖1a所示(P<0.01)。然后用熒光定量試驗(yàn)檢測(cè)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中與m6A相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，與MCF-7細(xì)胞相比，RNA甲基化酶wtap和去甲基化酶fto的mRNA在MCF-7/ADR細(xì)胞中高表達(dá)，而RNA甲基化酶mettl3、mettl14和閱讀基因ythdf2低表達(dá)，如圖1b所示(P<0.05)。我們選取RNA甲基化酶wtap進(jìn)行后續(xù)的研究，用western-blot試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)到MCF-7/ADR細(xì)胞中WTAP蛋白高表達(dá)，與mRNA表達(dá)水平一致，如圖1c所示。這說明WTAP在MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，提示wtap可能與乳腺癌細(xì)胞的耐藥有關(guān)。

圖1 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中m6A相關(guān)基因的mRNA和WTAP蛋白表達(dá)分析Fig.1 Expression analysis of mRNA level of m6A related genes and WTAP protein in MCF-7 and MCF-7/ADR cells(a)MTT法檢測(cè)阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞活力的影響；(b)qPCR試驗(yàn)檢測(cè)m6A相關(guān)基因在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)；(c)Western-blot試驗(yàn)檢測(cè)WTAP在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)，星號(hào)表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(a)MTT assay detected the effect of adriamycin on the activity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells;(b)qPCR assay detected the mRNA expression of m6A related genes in MCF-7 and MCF-7/ADR cells;(c)Western-blot assay detected the expression of WTAP in MCF-7 and MCF-7/ADR cells, the asterisks indicate a statistically significant difference(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)

2.2 過表達(dá)WTAP對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移沒有影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證wtap在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADR中的作用，我們構(gòu)建了wtap過表達(dá)質(zhì)粒。首先用PCR擴(kuò)增wtap基因的全長編碼序列，獲得1 191 bp的片段，如圖2a所示，將其插入pCMV-Myc真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切驗(yàn)證，得到相應(yīng)的wtap片段，如圖2b所示。將質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示pCMV-Myc-wtap構(gòu)建成功。擴(kuò)增正確的pCMV-Myc-wtap質(zhì)粒，進(jìn)行大量制備，以轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，用western blot鑒定pCMV-Myc-wtap重組質(zhì)粒，如圖2c所示，結(jié)果說明pCMV-Myc-wtap重組質(zhì)粒已成功表達(dá)WTAP蛋白。我們?cè)贛CF-7細(xì)胞中過表達(dá)WTAP，用細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)WTAP對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響。在過表達(dá)WTAP后，MCF-7細(xì)胞的遷移相比對(duì)照組沒有發(fā)生顯著性的變化，結(jié)果如圖2d所示，2e為2d圖的細(xì)胞遷移情況做量化統(tǒng)計(jì)。這些結(jié)果表明WTAP對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移沒有影響。

圖2 pCMV-Myc-wtap重組質(zhì)粒的酶切鑒定及對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-wtap by the digestion and the effect of WTAP on the migration of MCF-7 cells(a)wtap的PCR片段；(b)pCMV-Myc-wtap重組質(zhì)粒EcoRI和KpnI的雙酶切；(c)Western-Blot檢測(cè)外源WTAP的表達(dá)；(d,e)遷移試驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)WTAP對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響(a)PCR fragments of wtap;(b)Recombinant plasmid pCMV-Myc-wtap by EcoRI and KpnI digestion;(c)Western-Blot detected the expression of exogenous WTAP;(d,e)Transwell assay detected the effect of WTAP overexpression on cell migration of MCF-7cells

2.3 敲低WTAP的表達(dá)會(huì)抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移

我們用WTAPsiRNA干擾片段轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞，用western blot檢測(cè)WTAP siRNA干擾片段的有效性，結(jié)果如圖3a所示，表明WTAP siRNA的干擾片段是有效的。然后進(jìn)一步用細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)WTAP敲低對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞遷移的影響。相比較于對(duì)照組，敲低WTAP的表達(dá)會(huì)抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移，結(jié)果如圖3b所示(P<0.001)。圖3c對(duì)圖3b細(xì)胞的遷移情況做量化統(tǒng)計(jì)。該結(jié)果表明敲低WTAP的表達(dá)會(huì)抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移。

圖3 敲低WTAP對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of WTAP knockdown on migration of MCF-7/ADR cells(a)Western-blot檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞中WTAP siRNA轉(zhuǎn)染效果；(b,c)遷移試驗(yàn)檢測(cè)敲低WTAP對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞遷移的影響,星號(hào)表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(a)MCF-7/ADR cells transfected with WTAP siRNA was detected by western-blot；(b,c)Transwell assay detected the effect of WTAP knockdown on the cell migration of MCF-7/ADR cells, the asterisks indicate a statistically significant difference(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)

2.4 敲低WTAP的表達(dá)會(huì)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

我們用pCMV-Myc-wtap轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，WTAP siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞，分別培養(yǎng)至24 h和48 h，收集蛋白，western-blot檢測(cè)WTAP、Snail、Vimentin和E-cadherin、N-cadherin蛋白水平的變化，GAPDH做內(nèi)參。當(dāng)在MCF-7細(xì)胞中增加WTAP的表達(dá)時(shí)，和對(duì)照組相比上皮分子標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)沒有差異性的變化，結(jié)果如圖4a所示。而在MCF-7/ADR細(xì)胞中敲低WTAP的表達(dá)時(shí)，和對(duì)照組相比上皮分子標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)則下調(diào)，結(jié)果如圖4b所示。這些結(jié)果表明敲低WTAP的表達(dá)能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 Western-blot檢測(cè)敲低和過表達(dá)WTAP對(duì)E-cadherin、Snail、Vimentin和N-cadherin的影響Fig.4 Effects of WTAP knockdown and overexpression on E-cadherin,Snail,Vimentin and N-cadherin detected by western-blot(a)Western blot檢測(cè)pCMV-Myc-wtap轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞對(duì)E-cadherin,Snail,Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響;(b)Western- blot檢測(cè)WTAP siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)E-cadherin、Snail、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響(a)Westernblot detected the effect of WTAP overexpression on E-cadherin、Snail、Vimentin and N-cadherin of MCF-7 cells;(b)Western- blot detect the effects of WTAP knockdown on E-cadherin、Snail、Vimentin and N-cadherin of MCF-7/ADR cells

3 討論

WTAP由Little NA等首次發(fā)現(xiàn)，因與Wilms腫瘤抑制基因wt1特異性相互作用從而得名[35]。研究證明，wtap除了參與mRNA穩(wěn)定[36]、眼睛發(fā)育[37]、m6A甲基化[38]、細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控[39]等一些基本的生理過程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用，如WTAP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤組織樣本中高表達(dá)，通過EGF-EGFR-AKT信號(hào)軸參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[40-42]。在急性髓性白血病細(xì)胞異常增殖中wtap也起重要作用[26]。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)，在直腸癌細(xì)胞中CA4通過與WTAP發(fā)生相互作用，使WTAP多聚泛素化使其表降解進(jìn)而減少WTAP/WT1復(fù)合物，增加游離的WT1，促進(jìn)WT1與TBTL1發(fā)生相互作用進(jìn)而降解β-catenin從而降低Wnt信號(hào)通路抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的EMT和G1/S期。對(duì)于膽管癌，過表達(dá)或者干擾WTAP會(huì)增加或減少膽管癌細(xì)胞的遷移與侵襲[44]。一系列研究證明了wtap參與了腫瘤的增殖、遷移與侵襲，但對(duì)于雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療耐藥有何意義，目前尚暫無報(bào)道。

為了探索wtap在雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌耐藥中的作用，本研究選取雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌MCF-7和耐阿霉素藥物的乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞系進(jìn)行研究。WTAP在MCF-7/ADR細(xì)胞中高表達(dá)，表明WTAP可能參與乳腺癌MCF-7細(xì)胞的耐藥過程。Jeon[45]和W[46]等發(fā)現(xiàn)耐藥的腫瘤細(xì)胞通常會(huì)伴隨著許多其他細(xì)胞生物活性方面的變化，包括腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲性的增加。為了更深入研究WTAP參與乳腺癌MCF-7細(xì)胞的耐藥的作用，我們?cè)贛CF-7/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)入WTAP siRNA，通過遷移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低WTAP表達(dá)后MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移能力也隨之降低，而在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)WTAP則對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移沒有影響。總之，本試驗(yàn)表明敲低WTAP的表達(dá)可以抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移能力。

有研究證明，化療藥物常導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的增加[47,48]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞失去極性而重組細(xì)胞骨架，轉(zhuǎn)變具有遷移能力的間質(zhì)表型的過程，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個(gè)多步驟的過程，伴隨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化和多種上皮和間充質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和水平改變有關(guān)。冀峰等[49]發(fā)現(xiàn)耐阿霉素藥物的乳腺癌MCF-7的EMT能力比MCF-7腫瘤細(xì)胞要更強(qiáng)。本研究顯示，wtap基因表達(dá)受到抑制后，MCF-7/ADR細(xì)胞中的EMT過程受到抑制，表現(xiàn)為上皮分子標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)。這表明抑制wtap基因的表達(dá)，減弱了MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移能力，其中的機(jī)制可能和EMT過程受到抑制有關(guān)。EMT在多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色[50-52]。盡管EMT所涉及的分子機(jī)制取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但是EMT作為治療耐藥的潛在生物標(biāo)志物和潛在藥物靶點(diǎn)的臨床意義值得進(jìn)一步研究。WTAP作為一個(gè)癌基因，參與了不同腫瘤的增殖、遷移與侵襲[42-44]。本研究也表明WTAP通過影響EMT的發(fā)生參與乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥，因此WTAP可以作為臨床治療耐藥的潛在生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)之一。