徐佳瑩，李 演，謝芝玲，陳漢娜，潘 登，劉 峰，陳 燕，梁淑淑，丁學(xué)知，夏立秋，張友明,，涂 強(qiáng)*

(1．淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長沙 410081； 2．亥姆霍茲抗感染國際實(shí)驗(yàn)室， 山東大學(xué)亥姆霍茲生物技術(shù)研究所， 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266237； 3．青島科技大學(xué)， 化學(xué)與分子工程學(xué)院， 青島 266042；4．禹城保立康生物飼料有限公司， 德州 251200)

動物腸道中都包含著一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，腸道中的微生物與宿主的各項(xiàng)生命活動息息相關(guān)，它們可能影響著宿主的生長代謝活動，營養(yǎng)消化功能，免疫功能以及抵御入侵病原體的能力等[1-3]。例如，微生物產(chǎn)生的活性產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以抑制某些哺乳動物腸道中有害細(xì)菌的增殖來維持微生物群動力學(xué)，而且能夠增強(qiáng)腸道及遠(yuǎn)處組織的免疫能力[4]。腸道環(huán)境與宿主的生長代謝密切相關(guān)，體內(nèi)益生菌對維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定起著非常重要的作用，其產(chǎn)生的抗菌肽可直接抑制病原體生長，或?yàn)樗拗魈峁┫窬S生素一類的有益生長底物[5]。當(dāng)宿主生長狀態(tài)或外界環(huán)境發(fā)生變化時，往往會引起動物的腸道微生物也發(fā)生改變，有研究表明，斑馬魚腸內(nèi)的細(xì)菌群落隨著宿主由幼體到成熟不斷生長而變得越來越多樣化[6]。在進(jìn)行草魚的腸道微生物研究中，喂養(yǎng)黑麥草能夠顯著增強(qiáng)腸道微生物群的碳水化合物、氨基酸和脂質(zhì)的代謝作用[7]。

魚的生長水環(huán)境中高豐度的銅綠假單胞菌會引起魚的腸道杯狀細(xì)胞增殖和腸脫落，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而改變腸道菌群結(jié)構(gòu)[11]。硫化物對水體的污染會引起凡納濱對蝦腸道組織損壞，炎癥和免疫相關(guān)因子發(fā)生一系列的變化，使得腸道中潛在病原菌數(shù)量增加，有益菌數(shù)量減少[12]。目前，腸道微生物在生物研究領(lǐng)域起著越來越重要的作用，16s rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)作為研究微生物群落的重要手段，能夠鑒定出腸道中幾乎所有物種，并能基于測序數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的生物分析，從而快速地推動動物腸道微生物的研究和發(fā)展。

湖南省屬于我國華中地區(qū)，界于北緯24°38′～30°08′，東經(jīng)108°47′～114°15′之間，多山地和湖泊，四季分明，淡水魚種類繁多；山東省屬于我國華東沿海地區(qū)，北緯34°22.9′～38°24.01′，東經(jīng)114°47.5′～122°42.3′之間，氣候較湖南相比更加干燥，盛產(chǎn)海水魚類，兩地相距1 100 km。對于兩地的草魚，鯽魚和鯉魚三個品種的腸道微生物的比較分析迄今尚無報(bào)道。

本試驗(yàn)選取湖南本土草魚、鯉魚和鯽魚各6尾，山東本土草魚、鯉魚和鯽魚各6尾，基于Ion S5TMXL測序平臺，對以上36個樣本的腸道微生物16s rRNA V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，分析腸道菌群結(jié)構(gòu)，比較有益菌和有害菌的豐度差異，為淡水魚的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

本試驗(yàn)共采集36個生長狀況良好、魚齡為1齡的魚樣，其中禹城魚塘和望城魚塘的草魚[平均體重(600±50)g]各6尾，組別為山東草魚組(SC組)和湖南草魚組(HC組)；禹城魚塘和望城魚塘的鯽魚[平均體重(170±30)g]各6尾，組別為山東鯽魚組(SJ組)和湖南鯽魚組(HJ組)；禹城魚塘和望城魚塘的鯉魚[平均體重(550±50)g]各6尾，組別為山東鯉魚組(SL組)和湖南鯉魚組(HL組)。超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行解剖，取其腸道內(nèi)容物置于無菌的EP管內(nèi)，迅速冷凍，放-80 ℃冷凍保存，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用Mobio公司PowerFecalTMDNA Isolation kit試劑盒提取36個樣本中的微生物基因組，擴(kuò)增16s rRNA 的V4高變區(qū)，引物名稱為515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCT AAT)?；贗on S5TMXL技術(shù)測序平臺，利用單端測序(Single-End)的方法，完成測序，測序數(shù)據(jù)用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

為了使測序數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確和可靠，需將原始數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)過質(zhì)控和過濾處理，得到的即是有效數(shù)據(jù)(clean data)?；谟行?shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行操作分類單位(operational taxonomic units,OTUs)聚類，并將OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋，可獲得物種分布及豐度情況?；贠TUs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制物種稀疏曲線，體現(xiàn)各樣本的測序深度是否已達(dá)飽和。α多樣性分析是對單個樣本內(nèi)部或組內(nèi)進(jìn)行分析，所得的數(shù)值可以體現(xiàn)樣本的物種豐富度和均勻度。LEfSe分析(LED effect size)可進(jìn)行兩個或多個樣本的比較，找到樣本與樣本之間的差異物種，識別不同的豐度特征線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值可代表差異物種對菌群結(jié)構(gòu)的影響大小。對樣本中四種有益菌[鏈霉菌屬(Streptomyces)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)]和五種有害菌[氣單胞菌屬(Aeromonas)，弧菌屬(Vibrio)，希瓦氏菌屬(Shewanella)，愛德華氏菌屬(Edwardsiella)和黃桿菌屬(Flavobacterium)]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探索腸道微生物群的穩(wěn)定性和抗變化性，利于對魚類病害的研究與防治。對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行以上多種分析，將兩地區(qū)的樣本做對應(yīng)的比較，可用于研究環(huán)境對淡水魚腸道微生物的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)量評估及物種多樣性分析

經(jīng)過質(zhì)控后，36個樣本共得到2 455 165個高質(zhì)量的16s rRNA V4擴(kuò)增子序列，以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類，共得到4 934個OTUs，6個組所共有的OTUs有543個。根據(jù)稀疏曲線可見曲線逐漸趨于平緩，表明所得數(shù)據(jù)已經(jīng)覆蓋樣本中絕大部分物種，測序數(shù)據(jù)趨于合理且可信度高(圖1a)。所有樣本的Good’s coverage指數(shù)均在99.0%以上，每個樣本都具有良好的抽樣完整性。shannon指數(shù)可以很好地反映樣本中物種豐富度和均勻度的大小，HJ和SJ，HC和SC，HL和SL進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)結(jié)果顯示，相比較的組間豐富度和均勻度無顯著差異性(P>0.05)。在相似性分析(analysis ofsimilarities，ANOSIM)中，基于Bray-Curtis距離值的秩次進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，山東草魚組和湖南草魚組比較中組間差異明顯大于組內(nèi)差異(R=0.307,P<0.05)，闡明不同的環(huán)境造成同一淡水魚品種的腸道微生物差異(圖1b)。鯽魚組和鯉魚組的ANOSIM分析結(jié)果中差異顯著性比較P>0.05，統(tǒng)計(jì)不具有顯著性。

圖1 樣本稀疏曲線和ANOSIM組間差異分析Fig.1 The rarefaction curves and analysis of ANOSIM differences (a)36個魚樣的樣本稀疏曲線；(b)HC組和SC組的ANOSIM組間差異分析(a)The rarefaction curves of 36 fish samples;(b)Analysis of ANOSIM differences between HC group and SC group

2.2 腸道微生物組成結(jié)構(gòu)

在門水平上，物種相對豐度柱形圖中可發(fā)現(xiàn)，HJ組和SJ組的最優(yōu)勢菌門為梭桿菌門(Fusobacteria)，且在兩個組中所占比例分別為(55.40±27.31)%和(38.44±19.72)%。在HJ組中，較優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)〔(19.24±17.05)%〕>硬壁菌門(Firmicutes)〔(15.80±5.07)%〕>擬桿菌門(Bacteroidetes)(7.58±5.01)%；而在SJ組中，較優(yōu)勢菌門為硬壁菌門〔(31.50±26.24)%〕>變形菌門〔(13.78±10.29)%〕>擬桿菌門〔(8.14±0.94)%〕。HC組和SC組的最優(yōu)勢菌門為擬桿菌門，在各組中占比分別為(35.88±15.55)%和(35.76±16.47)%。在HC組中，較優(yōu)勢菌門為硬壁菌門〔(28.89±19.80)%〕>變形菌門〔(26.75±17.65)%〕>梭桿菌門〔(5.37±3.45)%〕；而在SC中梭桿菌門〔(22.28±18.05)%〕>硬壁菌門〔(13.28±5.10)%〕>螺旋體(Spirochaetes)(12.02±0.41)%。HL組和SL組的最優(yōu)勢菌門為變形菌門，在各組中所占比分別為(34.31±18.24)%和(33.70±28.58)%，HL組中，較優(yōu)勢菌門為硬壁菌門〔(22.96±22.83)%〕>梭桿菌門〔(16.40±14.37)%〕>擬桿菌門(11.60±2.91)%，而在SL組中梭桿菌門〔(30.77±7.53)%〕>擬桿菌門〔(14.89±8.65)%〕>硬壁菌門(9.55±4.30)%(圖2a)。如圖2a中所見，同一品種的魚樣中，環(huán)境不同，但腸道微生物中最優(yōu)勢菌門為同一菌門，隨后較優(yōu)勢菌門相對豐度大小順序有所變化。6個組中，變形菌門、梭桿菌門、硬壁菌門和擬桿菌門在各組中的所占比之和均在80%以上(圖2a)。在屬水平上，來自兩不同地區(qū)的鯽魚和鯉魚的腸道最優(yōu)勢菌屬都是鯨桿菌屬(Cetobacterium)，草魚的最優(yōu)勢菌都是擬桿菌屬(Bacteroides)(圖2b)。因此，相對于同一品種來講，地區(qū)差異并未造成最優(yōu)勢菌屬的改變。

圖2 各組中腸道微生物門水平上和屬水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of gut microbiome taxa on phylum category and genus category in each groups(a)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組的腸道微生物門水平上的物種相對豐度；(b)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組腸道微生物屬水平上的物種相對豐度(a)Relative abundance of gut microbiome taxa on phylum category in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups;(b)Relative abundance of gut microbiome taxa on genus category in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups

2.3 LEfSe分析

HJ組和SJ組的LEfSe分析結(jié)果顯示，氣單胞菌屬(Aeromonas)，氣單胞菌科(Aeromonadaceae)，氣單胞菌目(Aeromonadales)在HJ組中顯著富集(LDA>2.0,P<0.05)(圖3a)。且維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和某些未鑒定的梭菌目(Clostridiales)在HJ組中的相對豐度遠(yuǎn)高于SJ組，而在SJ組中未見顯著差異的差異物種(LDA>2.0,P<0.05)(圖3a)。在HC組和SC組的LefSe分析圖中，弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌目(Vibrionales)和弧菌屬(Vibrio)在SC組中顯著密集，在SC組中硬桿菌(Firmicutesbacterium)和霍亂弧菌(Vibriocholerae)的相對豐度也高于HC組，梭菌綱(Clostridia)和梭菌目(Clostridiales)在HC組中顯著密集(LDA>2.0,P<0.05)(圖3b)。在HL組和SL組的LEfSe分析圖中，弧菌科，弧菌目和弧菌屬在SL組中顯著密集，而HL組中未見顯著差異的差異物種(LDA>2.0,P<0.05)(圖3c)。

圖3 LDA值分布柱狀圖Fig.3 Histogram of LDA value distribution(a)HJ和SJ組的LDA值分布柱狀圖；(b)HC和SC組的LDA值分布柱狀圖；(c)HL和SL組的LDA值分布柱狀圖(a)LDA value distribution histogram of HJ and SJ groups;(b)LDA value distribution histogram of HC and SC groups;(c)LDA value distribution histogram of HL and SL groups

2.4 4種有益菌和5種有害菌的分析比較

將4種有益菌和5種有害菌的相對豐度繪制成柱狀統(tǒng)計(jì)圖，4種有益菌的相對豐度柱狀圖中可見，3個品種的魚腸道中，4種有益菌的相對豐度所占比之和在兩地比較下差異不大(圖4a)；在5種有害菌的相對豐度柱狀圖中，相對豐度所占比之和在兩地比較下差異很大，其中HC組的氣單胞菌屬豐度遠(yuǎn)高于SJ組，HL組的氣單胞菌屬相對豐度遠(yuǎn)高于SJ組，而SC和SL的弧菌屬豐度遠(yuǎn)高于對應(yīng)的HC組和HL組(圖4b)。值得注意的是，愛德華氏菌屬不存在SJ組，SL組和SC組中，而在HJ組，HL組和HC組中都有較低豐度(圖4b)。這可能是因?yàn)樵谏綎|地區(qū)少有愛德華氏菌屬的存在，不易在淡水魚類中定植，或者山東地區(qū)的淡水魚中存在某些抑制該菌屬生長的條件。

圖4 各組中4種有益菌的相對豐度和5種有害菌的相對豐度Fig.4 Relative abundance of four beneficial bacteria and five harmful bacteria in each groups(a)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組中4種有益菌的相對豐度；(b)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組中5種有害菌的相對豐度(a)Relative abundance of four beneficial bacteria in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups;(b)Relative abundance of five harmful bacteria in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups

3 討論

本研究36個樣本包含3個淡水魚類品種，分別是草魚，鯽魚和鯉魚。在腸道微生物豐度分析中，除了SC組的變形菌門相對豐度不在前四，其他各組的魚腸道微生物均以變形菌門，梭桿菌門，硬壁菌門和擬桿菌門為主，同一菌門包含許多菌種，菌門的豐度大小受菌種豐度大小的直接影響，不同的環(huán)境可影響菌種豐度，菌門豐度也隨之發(fā)生改變。SC組中物種相對豐度排第四的是螺旋體，在HC組中也存在一定豐度的螺旋體，且少數(shù)螺旋體具有降解纖維素的能力[15,16]，如嗜熱螺旋體。草魚是一種典型的草食性魚類，腸道較長，需要更多的纖維素降解細(xì)菌來有效的攝取營養(yǎng)，因此推測本研究中的兩個草魚組均富含有較多螺旋體的原因與其腸道消化有關(guān)。許多優(yōu)勢菌群對宿主的生長代謝至關(guān)重要，如硬壁菌門的芽孢桿菌屬可提高消化酶活性，變形菌門中的假單胞菌可抑制弧菌生長，它們共同作用維持腸道環(huán)境穩(wěn)定。在LEfSe分析中，HJ組中氣單胞菌屬的相對豐度遠(yuǎn)高于SJ組，SC組和SL組的差異物種都是弧菌科，可見，相比于山東水環(huán)境，氣單胞菌屬更易定植在湖南水環(huán)境的鯽魚腸道中，而弧菌更易在山東水環(huán)境的草魚和鯉魚腸道中定植。

有報(bào)告指出，食草性魚類腸道微生物群的數(shù)量隨季節(jié)變化而變化，在更密集的喂養(yǎng)季節(jié)(如夏季)微生物數(shù)量更高，這是因?yàn)橄募緺I養(yǎng)物質(zhì)更多，環(huán)境溫度更高，有利于微生物的增殖[17]。然而本研究與以上研究的結(jié)論不同，兩地氣溫差異并未造成腸道菌群豐富度的明顯改變，可能是因?yàn)椴蓸拥臅r間為八月份，雖然北方整體氣溫要比南方低，但是兩地氣溫都在適宜微生物生長的區(qū)間內(nèi)，所以腸道中物種豐富度和均勻度無顯著差異。進(jìn)行β多樣性比較時，SC組和HC組的組間差異大于組內(nèi)差異，這可能是受到外界環(huán)境因素綜合的影響。很多環(huán)境因子都能夠?qū)δc道微生物產(chǎn)生不同的影響[13,18]，湖泊中常常不可避免的存在農(nóng)藥和重金屬污染問題，比如殺蟲劑五氯酚和抑霉唑均會顯著地引起魚體腸道菌群成分變化[19]，鉛和鎘會造成腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化[20,21]，水體中氨氣濃度影響魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，過量硝酸鹽或氨氮還會損害宿主免疫功能[8]。本試驗(yàn)兩湖泊所處地區(qū)不同，也必定存在不同的水質(zhì)和環(huán)境問題，組間差異大于組內(nèi)差異的試驗(yàn)結(jié)果能夠反映環(huán)境差異對魚類腸道菌群的影響，但還無法將具體的環(huán)境因子與造成的差異結(jié)果一一對應(yīng)。

本研究中選取的是生長狀況良好的淡水魚，在各組腸道環(huán)境中都存在一定豐度的病原菌，但并未表現(xiàn)出病理特征。魚類體內(nèi)存在免疫系統(tǒng)，當(dāng)遭受少量病原菌侵害時，魚體免疫機(jī)制會起到保護(hù)作用，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，抵制病原體入侵。當(dāng)致病菌達(dá)到一定條件會爆發(fā)魚類疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來損失。使用抗生素是魚類養(yǎng)殖部門控制疾病暴發(fā)的常見做法，然而抗生素的使用并非長久之計(jì)，耐藥菌的出現(xiàn)迫使研究者尋找新的抗生素替代品。有研究表明中草藥提取物可以對魚類的生長繁殖有益，如紫蘇籽提取物可以顯著提高水產(chǎn)動物的生長和飼料利用率[22]。但是中草藥的使用也存在一些效果不明顯且成本較高的難題，因此魚類益生菌的篩選是也逐漸成為了學(xué)者研究的熱點(diǎn)。潛在益生菌一般都具有非致病性，可調(diào)節(jié)腸道酸堿平衡，抑制病原菌生長，并通過不同途徑調(diào)節(jié)免疫[23]，飼喂乳桿菌能夠顯著提高牙鲆的免疫細(xì)胞吞噬活性和溶菌酶活性[23,24]，日糧中補(bǔ)充鏈霉菌增強(qiáng)了草魚免疫基因的表達(dá)，雙歧桿菌可提高腸上皮組織完整性[25]，枯草芽孢桿菌作為飼料補(bǔ)充劑可以增強(qiáng)石斑魚的固有免疫，降低虹膜病毒感染的死亡率[23,26]。有學(xué)者的研究報(bào)告中顯示鯽魚的芽孢桿菌屬相對豐度在(0.308 2±0.526 4)%，氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬的相對豐度分別為(0.039 1±0.038 8)%和(0.121 1±0.104 9)%[27]，本試驗(yàn)中芽孢桿菌屬的豐度在該區(qū)間內(nèi)，各組的希瓦氏菌屬均高于該區(qū)間。雖然受到不同豐度的有害菌影響，定植在腸道中的鏈霉菌、乳桿菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌可能通過增強(qiáng)魚的固有免疫抵抗有害菌的入侵，保證魚體的正常生命活動。

本研究可以為淡水養(yǎng)殖業(yè)提供重要的理論參考，通過進(jìn)行不同地方同一品種淡水魚的腸道微生物分析可以看出，α多樣性比較無顯著差異，宿主自身因素對腸道菌群起主要調(diào)節(jié)作用。HC和SC組的組間差異大于組內(nèi)差異，可能是受環(huán)境差異影響。潛在有益菌和潛在致病菌在腸道內(nèi)存在某種平衡，雖然相對豐度不一樣，但并未致病。因此，為了保持腸道微生物間的平衡，后續(xù)還需要進(jìn)行更多的研究，從中尋找和制造更多的有益因素，減少有害因素的出現(xiàn)頻率，創(chuàng)造更大的收益。