海洋單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化研究

張媛 余蕾 雷楠 趙馨

摘 ? 要：海水微藻常見種之一的三角褐指藻，在培養(yǎng)觀察過程中，針對(duì)其細(xì)胞形狀多變、特定形狀細(xì)胞的生長周期不清晰等問題，結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板法，開展了對(duì)三角褐指藻單一細(xì)胞形狀（菱形）的保種、最優(yōu)接種量的確定及生長周期的觀察等的分析及優(yōu)化。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的單一藻細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)、生長等方法操作簡單，可為日常生物實(shí)驗(yàn)中有關(guān)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐，具有一定的實(shí)踐意義。

關(guān)鍵詞：單細(xì)胞藻類;三角褐指藻;細(xì)胞形狀;計(jì)數(shù);生長周期

硅藻是一類具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)意義的單細(xì)胞真核微藻，代表性硅藻物種—三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）作為一種模式硅藻廣泛應(yīng)用于藻類生理、生態(tài)方面的研究[1]。據(jù)報(bào)道，三角褐指藻是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)蛋白餌料，富含活性物質(zhì)如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、巖藻黃素[2]，是生產(chǎn)EPA的潛在原材料[3-4];是微藻生物柴油的重要原料，具有較高的中性脂三?；视停═AG）[5];對(duì)二氧化碳具有極高的耐受性，其光合固碳是生物法處理工廠廢煙氣的理想途徑[6];是應(yīng)用于生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的指示生物，可直接用來評(píng)價(jià)水質(zhì)的安全狀況[7]，是海洋浮游生物毒性測(cè)試中常用的實(shí)驗(yàn)材料[8];生長速度快，分布較廣，僅生活于海洋環(huán)境中，在中國沿岸海域均有分布[9]，取樣分析方便，有利于收集。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品添加、水質(zhì)安全等教學(xué)實(shí)驗(yàn)工作中，對(duì)于材料獲取方便、生長周期短、活性產(chǎn)物豐富的單細(xì)胞藻類開展相關(guān)培養(yǎng)研究，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

有關(guān)藻生理、生態(tài)的科研工作，常常以細(xì)胞豐度變化作為研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是最為直接、簡單的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，在高校日常教學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用于了解浮游植物的生長狀態(tài)、生物量測(cè)定甚至環(huán)境安全質(zhì)量等，實(shí)操手段簡單、實(shí)用價(jià)值高。經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是顯微鏡計(jì)數(shù)法，雖比較耗時(shí)費(fèi)力但準(zhǔn)確度高，且其計(jì)數(shù)流程簡單。然而，開展三角褐指藻生理生態(tài)等教學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的工作，需基于簡單易操作、重復(fù)性高的室內(nèi)藻類培養(yǎng)及觀察。三角褐指藻在形狀特征方面具有多態(tài)性，總體上有4種主要形狀類型：梭形、三出放射狀、卵形[10]和十字交叉型，且不同形狀間在不同培養(yǎng)條件下可相互轉(zhuǎn)化[11]。同時(shí)，三角褐指藻細(xì)胞間的黏附強(qiáng)度也與形狀類別密切相關(guān)[12]，對(duì)實(shí)驗(yàn)工作的分析造成了較大影響，包括細(xì)胞生長、不同生長階段藻細(xì)胞的周期性觀察等。本研究以加強(qiáng)教學(xué)實(shí)用性為目的，以常見海洋微藻三角褐指藻為研究對(duì)象，結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及常用計(jì)數(shù)觀察法（血球計(jì)數(shù)板法），開展三角褐指藻單一細(xì)胞形狀的分離、保種、初始接種量確定及生長周期觀察等的實(shí)驗(yàn)方法分析，優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)教學(xué)流程，獲得較為簡便、快捷、準(zhǔn)確、可行的藻細(xì)胞培養(yǎng)及其生理特征觀察等實(shí)驗(yàn)方法。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?藻種及其培養(yǎng)條件

三角褐指藻藻種由國家海洋局第三海洋研究所藻種室提供。

三角褐指藻的培養(yǎng)采用f/2海水液體培養(yǎng)基[13]，在三角錐瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng)。使用的海水為0.45 μm濾膜過濾的自然海水（pH 8.0±0.4，鹽度27‰～32‰）;加入藻細(xì)胞前，量取300 mL培養(yǎng)基裝于500 mL三角錐形瓶，經(jīng)121 ℃高壓滅菌處理。培養(yǎng)溫度為20 ℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h[14]。

1.2 ?主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備包括三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱KB-200L-3（匡貝）、凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D（蘇州凈化）、光學(xué)顯微鏡 ECLIPSE E200（Nikon）、血球計(jì)數(shù)板XB-K-25（求精）、高壓蒸汽滅菌鍋MJ-54A（STIK）、電子天平EX224（OHAUS）等。

1.3 ?藻類計(jì)數(shù)方法

顯微鏡計(jì)數(shù)法：將藻液用漩渦混勻器充分混勻后，加入 0.5%的戊二醛固定，然后將藻液充分混勻。準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度的藻液細(xì)胞0.1 mL，置于血球計(jì)數(shù)板上，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次取其平均值[15]。

2 ? ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 ?單一細(xì)胞形狀三角褐指藻的保種

三角褐指藻具有多種細(xì)胞形狀，且不同細(xì)胞形狀間可相互轉(zhuǎn)變，如梭形可變成三出放射狀，三出放射狀可變成十字交叉型，三出放射狀也可變成梭形等[10-11]。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展的藻類培養(yǎng)中也出現(xiàn)了該情況，如三角褐指藻經(jīng)過一定周期（2～4周以上）的培養(yǎng)，會(huì)在同一批液體培養(yǎng)基中同時(shí)出現(xiàn)菱形、三射型，甚至是四射型等形狀不一、比例不同的藻細(xì)胞混合液，一般為保持單一的細(xì)胞形狀，常用的做法是減少培養(yǎng)周期并定期移出少量原液至新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行重新接種。往往工作量較大，培養(yǎng)基用量也較多，且混入少量其他形狀細(xì)胞的概率非常大，易重新造成藻細(xì)胞形狀不純，重復(fù)后續(xù)單一形狀藻細(xì)胞的分離、純化工作。雖然可在重新接種前進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，排除可能存在的其他形狀細(xì)胞，但同時(shí)也增加了很多工作量，且成功排除率較低，效率不高。針對(duì)此，經(jīng)過一定時(shí)間的觀察、分析，通過參考96孔板等多孔板進(jìn)行藻細(xì)胞單一形狀純化的方式，本研究將經(jīng)過2周培養(yǎng)的單一細(xì)胞形狀的藻細(xì)胞（菱形），分批次（20 μL體積）加入到已添加新鮮f/2培養(yǎng)基（80 μL體積）的96孔板中（3組平行，共計(jì)96×3=288個(gè)樣品），并將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過10天的光暗周期培養(yǎng)，從96孔板中每個(gè)小孔板中取出50 μL藻液，置于玻璃載破片上面進(jìn)行全部細(xì)胞形狀的觀察，并記錄出現(xiàn)除菱形外的其他細(xì)胞形狀的小孔數(shù)量。部分結(jié)果如表1所示。

從結(jié)果可看出，經(jīng)過10天的培養(yǎng)，96孔板中僅有少數(shù)微孔出現(xiàn)非菱形細(xì)胞，且多數(shù)為三射型細(xì)胞;單一形狀的保種成功率為（288-14）/288≈95.14%。應(yīng)用該方法后又開展了幾次類似的實(shí)驗(yàn)工作，獲得的單一細(xì)胞形狀的保種成功率為93.75%～100.00%，保種成功率較高。上述實(shí)驗(yàn)說明，相對(duì)傳統(tǒng)方法，采用96孔板進(jìn)行細(xì)胞形狀多變的藻單一形狀的保種，保種成功率較高，其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率高且批次數(shù)量多、試劑耗材使用量少、易于操作等，可在今后的藻類實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。

2.2 ?三角褐指藻接種量確認(rèn)

藻細(xì)胞生長常有不同的生長階段（停滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期），為達(dá)到這一目的，在藻類培養(yǎng)過程中，需確定最初的藻細(xì)胞接種量，過低或過高都會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察。常用的計(jì)數(shù)方法是血球計(jì)數(shù)板法，通過已設(shè)置好的藻液體積，可在光學(xué)顯微鏡下較為準(zhǔn)確地計(jì)算出培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞濃度，應(yīng)用廣泛。然而，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)有一定的濃度限制[16]?；谶@一情況，本研究設(shè)置了起始細(xì)胞濃度（大于104個(gè)/mL）分在不同的兩組（A組和B組）藻細(xì)胞樣品（每組兩個(gè)平行分別是A1和A2，B1和B2）中，并計(jì)數(shù)觀察其生長情況。具體實(shí)驗(yàn)過程是，取經(jīng)過一定周期培養(yǎng)的藻細(xì)胞原液（約6.5×106個(gè)/mL）至含有相同體積（75 mL）的新鮮培養(yǎng)基的A1、A2、B1和B2，其中，A1和A2初始接種量是B1和B2的100倍。通過3天的計(jì)數(shù)觀察，具體結(jié)果如表2所示。

從結(jié)果可看出，稀釋了100倍的B1和B2經(jīng)過血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)后，其結(jié)果并不能真實(shí)反映藻類實(shí)際質(zhì)量濃度值，且還出現(xiàn)藻細(xì)胞空白個(gè)數(shù)的情況。但A1和A2中藻細(xì)胞質(zhì)量濃度，經(jīng)計(jì)算后為4.0×105個(gè)/mL，是原始母液的6.15%，這與母液接入量的比例（1/16）基本相同。觀察藻細(xì)胞隨時(shí)間的變化情況，可看出B1和B2的藻細(xì)胞在經(jīng)過4天的光暗周期培養(yǎng)后，基本達(dá)到了A1和A2中最初接入的藻細(xì)胞質(zhì)量濃度。這說明，在應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)三角褐指藻細(xì)胞質(zhì)量濃度時(shí)，較好地接入細(xì)胞質(zhì)量濃度應(yīng)在105個(gè)/mL以上，其獲得的質(zhì)量濃度值結(jié)果較為準(zhǔn)確、可信。

2.3 ?三角褐指藻一步生長曲線及其觀察

在藻類培養(yǎng)過程中，常需要對(duì)不同生長階段的細(xì)胞進(jìn)行各類參數(shù)的觀察、分析，常用的做法是開展一步生長曲線的實(shí)驗(yàn)觀察。通過前面藻細(xì)胞單一形狀的保種、接種量的觀察，本研究對(duì)三角褐指藻的一步生長曲線情況作了進(jìn)一步的分析，具體結(jié)果如圖1所示。

可以看出，初始接種量為4.0×103個(gè)/mL的三角褐指藻，在經(jīng)過14天的室內(nèi)恒定環(huán)境培養(yǎng)其生長可分為3個(gè)階段：停滯期（第1天到第4天）、指數(shù)生長期（第5天到第12天）、穩(wěn)定期（超過第12天）;其細(xì)胞密度從第一天的4.0×103個(gè)/mL，到第11天的9.8×106個(gè)/mL，增長了約2 450倍。生長曲線的制定，有助于在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中針對(duì)學(xué)生在開展藻細(xì)胞觀察時(shí)，為初始接種量的確定、觀察時(shí)間設(shè)置、觀察頻次設(shè)置、不同生長階段細(xì)胞大小觀察、形狀變化分析以及其他形狀如三射型、四射型細(xì)胞培養(yǎng)等提供數(shù)據(jù)支持。

2.4 ?實(shí)驗(yàn)小結(jié)

相對(duì)傳統(tǒng)方法，采用96孔板進(jìn)行細(xì)胞形狀多變的藻單一形狀的保種，保種成功率較高，其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率高且批次數(shù)量多、試劑耗材使用量少、易于操作等。在日常教學(xué)中，為引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行準(zhǔn)確的生長周期觀察，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行三角褐指藻細(xì)胞質(zhì)量濃度計(jì)數(shù)時(shí)，較好地接入細(xì)胞質(zhì)量濃度應(yīng)在105個(gè)/mL以上，其獲得的質(zhì)量濃度值結(jié)果較為準(zhǔn)確、可信。

3 ? ?結(jié)語

目前，多數(shù)學(xué)校（大中專）在生物專業(yè)的教學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中，多以微生物（細(xì)菌）培養(yǎng)來引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)個(gè)體較小、繁殖力強(qiáng)的生物個(gè)體及其生理特征，造成了課程體系千篇一律、學(xué)生接觸面小、興趣點(diǎn)不足、創(chuàng)新力不強(qiáng)等常見狀況。海洋微藻與微生物（細(xì)菌）類似，個(gè)體小、數(shù)量多、易培養(yǎng)、易觀察、門類多等，是濱海城市海洋水體中常見的生物種，在海洋環(huán)境中具有重要生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在日常教學(xué)中有的放矢地制定相關(guān)藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)課程，可進(jìn)一步拓寬學(xué)生知識(shí)面，提高其實(shí)驗(yàn)積極性，有助于實(shí)驗(yàn)技術(shù)技能的增強(qiáng)。

海洋微藻作為我國海洋生物資源保護(hù)、開發(fā)的重點(diǎn)，開展藻類純化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的教師，也可通過日常教學(xué)中對(duì)于藻細(xì)胞周期等生理生化特征的觀察、純化等，發(fā)現(xiàn)具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藻類物種，響應(yīng)國家有關(guān)高校產(chǎn)學(xué)機(jī)制的政策，做到產(chǎn)學(xué)高效運(yùn)行“兩不誤”。本研究中的三角褐指藻，即是一類具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)意義的單細(xì)胞真核微藻硅藻的代表性藻種之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物毒害檢測(cè)、活性物質(zhì)開發(fā)等領(lǐng)域已被廣泛報(bào)道。與生物專業(yè)日常實(shí)驗(yàn)教學(xué)中常用的微生物（細(xì)菌）特征類似，三角褐指藻具有微藻特征優(yōu)勢(shì)，可作為一類重要的實(shí)驗(yàn)材料。本研究結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板法，完成了對(duì)三角褐指藻單一細(xì)胞形狀的保種、接種量大小及生長階段觀察等方面的分析及優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為日常生物實(shí)驗(yàn)中有關(guān)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐，具有實(shí)踐意義。

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Abstract：Phaeodactylum tricornutum， one of the common species of seawater microalgae， has a variety of cell morphologies and unclear growth cycles of specific shaped cells during inculture. Combined wtih traditional optical microscopy and blood cell counting plate method，the analysis and optimization of the conservation of unicellular algae （diamond）， the determination of the optimal inoculum size， and the observation of the growth cycle were carried out in this study. The results show that isolation and counting of unicellular algae in this study are simple and easy to operate， which can provide data support for the optimization of algae cultivation and observation in daily biological experiments.

Key words：unicellular algae; phaeodactylum tricornutum; cell morphology; cell count; growth cycle