王陸亞，李 瑤，郭曉宇，余濟(jì)源，張 蕊，焦亞華，王玉榮*

（1.天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

紅曲霉菌（Monascusspp.）又稱紅曲菌，是一種重要的食用微生物，能產(chǎn)生紅曲色素、莫納可林K、γ-氨基丁酸等大量有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物，近年來受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[1]。然而，紅曲霉菌也會(huì)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物桔霉素（citrinin），又名桔青霉素，是一種真菌毒素，具有一定的抑菌活性和細(xì)胞毒性[2]，對(duì)動(dòng)物的腎臟、肝臟、心臟、胃腸道等器官具有很強(qiáng)的毒性[3]。因此，紅曲產(chǎn)品的安全性受到普遍關(guān)注，歐洲及美國、日本等國家都對(duì)紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。桔霉素的存在降低了紅曲霉菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的安全性，限制了紅曲霉菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用。因此，研究桔霉素的代謝及調(diào)控機(jī)制，降低紅曲米等紅曲發(fā)酵產(chǎn)品的桔霉素含量具有重要的意義。

作為一種聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，桔霉素以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為原料，在聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）及一系列氧化還原酶的作用下生成[4]。產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌主要包括紫色紅曲霉（Monascus purpureus）、安卡紅曲霉（Monascus ruber）、叢毛紅曲霉（Monascus pilosus），尤其是紫色紅曲和安卡紅曲，他們都具有桔霉素合成基因簇[5]。桔霉素合成相關(guān)基因成簇排列，共44 kbp，16個(gè)基因[6]。其中，ctnA基因是轉(zhuǎn)錄因子[7]，對(duì)桔霉素的產(chǎn)量具有非常重要的正調(diào)控作用；orf7基因?qū)勖顾睾铣删哂胸?fù)調(diào)控作用[8]，pksCT作為聚酮合酶基因，對(duì)桔霉素合成有關(guān)鍵作用。此外，LaeA、VeA等全局性轉(zhuǎn)錄因子在真菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[9]，對(duì)真菌的初級(jí)代謝、次級(jí)代謝、生長(zhǎng)和發(fā)育都具有調(diào)控作用，LaeA是甲基轉(zhuǎn)移酶基因，VeA是真菌特有的Velvet蛋白家族，含有Velvet結(jié)構(gòu)域，LaeA和VeA可以調(diào)控真菌的多個(gè)下游轉(zhuǎn)錄因子。PKA信號(hào)通路是真菌非常重要的信號(hào)通路，傳遞外界信號(hào)，調(diào)節(jié)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝等各種生理功能[10]。

紅曲霉菌桔霉素的代謝受光照、pH值、溫度、溶氧、培養(yǎng)基成分等條件的影響[11-15]，但影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究以產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉（M.purpureus）M9為研究對(duì)象，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定其在紅光、藍(lán)光、黑暗條件下的桔霉素產(chǎn)量，并利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）對(duì)桔霉素相關(guān)合成基因簇（ctnA、pksCT、orf7基因）、全局性轉(zhuǎn)錄因子（LaeA、VeA基因）及pka基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，研究光照對(duì)紅曲霉桔霉素代謝機(jī)制的影響。有助于闡明桔霉素代謝調(diào)控機(jī)制，為低桔霉素紅曲霉發(fā)酵及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供研究思路和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紫色紅曲霉（M.purpureus）M9：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院保藏。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）：德國Merko公司；無水乙醇、磷酸（均為色譜純）：天津市百世化工有限公司；桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：美國Sigma公司；E.Z.N.A.TM Fungal核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）Kit：美國OMEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript cDNA Synthesis kit：江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量試劑盒TB Green Premix ExTaqⅡ：寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基[16]：麥芽汁（糖度10°Bx），瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基[17]：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO410 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L。

YES培養(yǎng)基：蔗糖160 g/L，酵母浸粉40 g/L。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、1260高效液相色譜儀（帶有G1321A熒光檢測(cè)器）：美國安捷倫科技公司；S1000梯度PCR儀：美國伯樂公司；Allegra 25R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；DGG-101-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

活化：將紅曲霉M9接種于斜面保藏培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d。

種子液制備：活化的紅曲霉M9中加入1 mL無菌水，將孢子刮下，制成孢子懸液，將孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)30 h，得種子液。

培養(yǎng)：將M9種子液制成孢子懸浮液（2×106個(gè)/mL），按照10%（V/V）的接種量接種于YES培養(yǎng)基中，分別在光照強(qiáng)度為150 lux的藍(lán)光（400 nm）和紅光（700 nm）及黑暗條件下30 ℃培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d及11 d取樣，測(cè)定生物量、桔霉素，并進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。

1.3.2 生物量的測(cè)定

在培養(yǎng)3d、5d、7d、9d及11d時(shí)取樣，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心25 min，收集菌絲體沉淀，用蒸餾水沖洗后離心，棄去上清液，重復(fù)3次；收集的菌絲體于60 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱量。

1.3.3 桔霉素的檢測(cè)

取0.5 mL發(fā)酵液，加入9.5 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，60 ℃保溫1 h，6 000 r/min 離心10 min，取上清，用0.45 μm濾膜過濾。采用HPLC法測(cè)定桔霉素含量[15]。

HPLC條件：色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水∶乙腈∶甲醇=30∶50∶20（V/V），pH 2.6；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；熒光檢測(cè)器；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.4 基因表達(dá)量分析

ctnA、pksCT及orf7基因的引物序列參考文獻(xiàn)[18]。參考M.purpureusYY-1基因組序列，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)LaeA、VeA、pka、β-actin基因的引物[19]，β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 LaeA、VeA、pka及β-actin基因的引物序列Table 1 Sequences of primers of LaeA、VeA、pka and β-actin genes

利用E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit提取總RNA，以其為模板，利用HiFiScriptcDNASynthesiskit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用TB Green Premix ExTaqⅡ試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)熒光定量分析。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照條件下菌體生物量及桔霉素產(chǎn)量

藍(lán)光、紅光、黑暗條件下，紫色紅曲霉M9的菌體生物量和桔霉素產(chǎn)量見圖1。

圖1 不同光照條件下紫色紅曲霉M9的生物量和桔霉素產(chǎn)量Fig.1 Biomass and citrinin yield of Monascus purpureus M9 under different light conditions

由圖1可知，藍(lán)光條件下，紫色紅曲霉M9的生長(zhǎng)速度最慢，生物量最低，桔霉素產(chǎn)量最高。與黑暗條件相比，培養(yǎng)11 d，藍(lán)光條件下菌體生物量降低15.85%，桔霉素產(chǎn)量升高30.40%；紅光條件下菌體生物量無顯著差異（P＞0.05），桔霉素產(chǎn)量降低35.26%。結(jié)果表明，藍(lán)光有利于紫色紅曲霉M9產(chǎn)桔霉素，而紅光能抑制其產(chǎn)桔霉素。

2.2 不同光照條件下桔霉素合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

藍(lán)光、紅光、黑暗條件下，紫色紅曲霉M9中桔霉素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量見圖2。

由圖2可知，與黑暗條件相比，紅光抑制ctnA、pksCT基因的表達(dá)，促進(jìn)orf7基因的表達(dá)，在培養(yǎng)5 d時(shí)抑制（促進(jìn)）作用最強(qiáng)，相對(duì)表達(dá)量分別為黑暗條件下的25.90%、30.77%、292.93%。藍(lán)光促進(jìn)ctnA、pksCT基因的表達(dá)、抑制orf7基因的表達(dá)，在培養(yǎng)3 d時(shí)促進(jìn)（抑制）作用最強(qiáng)，相對(duì)表達(dá)量分別為黑暗條件下的151%、167%、34%。ctnA是桔霉素基因簇的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)pksCT、orf4等多個(gè)基因具有激活作用，正調(diào)控桔霉素的合成代謝[20]。orf7是桔霉素的合成抑制因子，有研究表明，敲除orf7基因可以提高桔霉素產(chǎn)量142.4%[8]。結(jié)果表明，光照影響基因簇內(nèi)部的激活轉(zhuǎn)錄因子ctnA、抑制因子orf7及合成關(guān)鍵基因pksCT的轉(zhuǎn)錄水平。

圖2 不同光照對(duì)紫色紅曲霉M9中ctnA（a）、pksCT（b）及orf7（c）基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of different light on relative expression quantity of ctnA (a), pksCT (b) and orf7 (c) genes in Monascus purpureus M9

2.3 不同光照條件下全局轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量

圖3 不同光照對(duì)紫色紅曲霉M9中LaeA（a）及VeA（b）基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of different light on relative expression quantity of LaeA (a) and VeA (b) genes in Monascus purpureus M9

藍(lán)光、紅光、黑暗條件下，紫色紅曲霉M9中LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量見圖3。由圖3可知，與黑暗條件比較，紅光能促進(jìn)全局性轉(zhuǎn)錄因子LaeA、VeA基因的表達(dá)，藍(lán)光能抑制LaeA、VeA基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量降低，桔霉素產(chǎn)量升高，LaeA和VeA基因相對(duì)表達(dá)量升高而桔霉素產(chǎn)量降低，說明光照通過調(diào)控紅曲全局性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，調(diào)控桔霉素的合成代謝。

2.4 不同光照條件下pka基因相對(duì)表達(dá)量

藍(lán)光、紅光、黑暗條件下，紫色紅曲霉M9中pka基因相對(duì)表達(dá)量見圖4。

圖4 不同光照下紫色紅曲霉M9中pka基因的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of different light on relative expression quantity of pka in Monascus purpureus M9

光照、溫度、溶氧等外界信號(hào)需要通過信號(hào)通路傳遞，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的調(diào)控作用。由圖4可知，與黑暗條件比較，紅光促進(jìn)了pka基因的表達(dá)，藍(lán)光抑制了pka基因的表達(dá)。并且pka基因相對(duì)表達(dá)量升高，桔霉素產(chǎn)量降低；pka基因相對(duì)表達(dá)量降低，桔霉素產(chǎn)量升高。結(jié)果表明，PKA信號(hào)通路能夠響應(yīng)紅光、藍(lán)光等不同的光照條件對(duì)不同光信號(hào)產(chǎn)生不同的反應(yīng)，并將信號(hào)進(jìn)一步傳遞，直到引起桔霉素代謝的變化，并且與桔霉素產(chǎn)量負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

研究光照對(duì)紅曲霉桔霉素代謝機(jī)制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與黑暗條件相比，藍(lán)光條件下菌體生物量降低15.85%，桔霉素產(chǎn)量升高30.40%；紅光條件下生物量無顯著差異（P＞0.05），桔霉素產(chǎn)量降低35.26%。藍(lán)光促進(jìn)ctnA和pksCT基因的表達(dá)、抑制orf7、LaeA、VeA和pka基因的表達(dá)，紅光抑制ctnA和pksCT基因的表達(dá)、促進(jìn)orf7、LaeA、VeA和pka基因的表達(dá)。結(jié)果表明，光照通過調(diào)控LaeA、VeA和pka基因的表達(dá)量進(jìn)行信號(hào)傳遞，調(diào)控桔霉素基因簇重要的調(diào)控因子ctnA和orf7，改變桔霉素合成基因pksCT表達(dá)量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)桔霉素產(chǎn)量的調(diào)控作用。