杜 陽 李 良 周成友

東南大學附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)(南京市大廠醫(yī)院) (南京,210044)

宮頸癌是婦科臨床常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率居女性惡性腫瘤第二位,死亡率僅次于乳腺癌[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為長度超過200個核苷酸、無蛋白質編碼能力的非編碼RNA,能在選擇性剪接、基因印記、核內運輸、細胞分化以及RNA衰變等不同的生物過程中起重要作用[2]。相關研究表示[3],敲減linc00511會抑制宮頸癌細胞增殖,能有效降低腫瘤細胞對紫杉醇的抵抗力。因此,本研究檢測宮頸癌患者Linc00511表達情況并分析其臨床意義,為宮頸癌的早期診斷及臨床靶基因治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年1月—2014年4月在本院確診的92例宮頸癌患者的癌組織及其癌旁組織標本。納入標準：①符合宮頸癌診斷標準[4]；②均經(jīng)宮頸或宮頸管活檢組織檢查后確診為宮頸癌；③年齡18～80歲。排除標準：①術前接受放化療、內分泌、生物靶向治療等抗腫瘤藥物治療患者；②合并生殖系統(tǒng)結核患者；③合并嚴重肝、腎、心、血管功能疾病患者；④其他惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 治療方案

92例宮頸癌患者均在術后采取紫杉醇類聯(lián)合鉑類藥物規(guī)范治療,耐藥的復發(fā)患者接受二線化療藥物聯(lián)合化療。

1.3 組織中 Linc00511 檢測

采用實時定量PCR法檢測宮頸癌組織及癌旁組織中Linc00511表達。提取組織中RNA,加入500 μml TRIzol試劑裂解,置1.5 ml無酶EP管中。加入100 μl氯仿,室溫靜置3 min, 12000 r/min離心15 min；取200μl上層清液,置1.5ml EP管中,加入250 μl異丙酮混勻,靜置10 min,于12000 r/min離心10 min；棄上清液,以含DEPC的75.0%乙醇溶液洗滌；洗滌沉淀3次后,待RNA沉淀基本透明后,加入不含RNase的ddH2O至充分溶解,測定RNA質量和濃度。按照Takara RR036A試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA,并用CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)測定Linc00511。Linc00511上游引物5’-TCTCCTTGTGCAAACCTCC-3’,下游引物為5’-CCCACATTGAGCGAATGCC-3’；內參GAPDH上游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’,下游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’。反應體系(10μl)為2×iTaqTM Universal SYBR Green Supermix 5 μl,上下游引物(0.4μmol/L)各0.4μl,cDNA 0.8μl,RNase Free H2O 3.8μl。反應條件：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,共40個循環(huán),65～95 ℃溶解曲線分析。3個復孔/次,重復3次。目的基因的表達采取2-ΔΔCt法進行相對定量,中位數(shù)以上為高表達,反之為低表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般情況

92例患者年齡(46.4±8.6)歲(18～80歲)；其中腺癌28例,鱗癌64例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期Ⅰ期37例,Ⅱ期43例,Ⅲ期9例,Ⅳ期3例；分化程度為低分化13例,中分化27例,高分化52例；淋巴結轉移20例,無淋巴結轉移72例。

2.2 組織中 Linc00511 表達

Linc00511在宮頸癌組織中的表達量(3.26±1.17)高于癌旁組織中(1.14±0.83)(t=14.175,P<0.05)。

2.3 Linc00511 表達與病理關系

92例患者中,Linc00511高表達36例、低表達56例。在宮頸癌和癌旁組織中,Linc00511高表達與患者年齡、分化程度、病理分型無關(P>0.05),與FIGO分期、淋巴結轉移、腫瘤大小有關(P<0.05)。見表1。

表1 Linc00511 高表達與相關因素關系[例(%)]

2.4 Linc00511 與患者生存關系

所有患者均在術后隨訪5年,患者5年生存率Linc00511高表達者(51.8%)低于Linc00511低表達者(72.2%)(χ2=3.909,P=0.048)。Linc00511高表達與低表達患者的中位生存時間均在5年以上,生存曲線見圖1。

圖1 生存情況分析

3 討論

宮頸癌作為女性常見惡性腫瘤發(fā)病影響因素多,過程長,預后差,患者中位生存時間短,中晚期患者5年生存率在70.0%左右,是女性惡性腫瘤死亡的主要原因[5]。惡性腫瘤的分子生物學基礎通常表現(xiàn)為促癌基因的激活與抑癌基因的失活[6]。隨著近年來分子生物學領域的不斷發(fā)展,分子生物學為惡性腫瘤的早期診斷、手術治療效果及術后輔助治療、預后評價等提供了一定依據(jù)。Ki-67[7]、Snail[8]、CK2β[9]等基因被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的預后關系密切。Linc00511是一種非編碼RNA,敲減Linc00511能抑制多種癌細胞的增殖、遷移[10-11]。因此,為尋找更好的宮頸癌治療新靶點,延長患者存活時間,本研究觀察了Linc00511在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義。

近年來相關研究發(fā)現(xiàn),多種lncRNA在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在異常表達,并充當調節(jié)劑的作用[12]。目前已有多種lncRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的研究報道,如：LncRNA H19在宮頸癌中的表達明顯升高,且術后其表達量明顯降低,可作為宮頸癌臨床診斷和術后監(jiān)測潛在的循環(huán)標記物[13]；lncRNA HOTAIR在宮頸癌細胞中的表達水平明顯高于癌旁正常功能上皮細胞,而外源性敲低宮頸癌Hela癌細胞HOTAIR RNA表達對宮頸癌細胞的增殖與遷移均起到抑制作用[14]；最新研究發(fā)現(xiàn)[3],抑制Linc00511表達能抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移,促進宮頸癌細胞凋亡。本研究結果發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中Linc00511表達量高于癌旁正常組織。與上述研究[3]結果相似。說明Linc00511可能是作為促癌基因,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究將Linc00511在宮頸癌組織細胞中的表達水平按照中位數(shù)以上為高表達,以下為低表達進行區(qū)分,分析了Linc00511表達與宮頸癌患者臨床病例特征的關系。結果發(fā)現(xiàn),患者年齡、分化程度、病理分型與Linc00511高表達無關,FIGO分期、淋巴結轉移、腫瘤大小與Linc00511高表達關系密切。提示Linc00511可能是促進宮頸癌發(fā)展與轉移的重要因素,可作為宮頸癌進展及轉移風險的一個預測因子。生存曲線對比情況顯示,Linc00511高表達患者5年生存率低于Linc00511低表達患者。說明Linc00511高表達可能是宮頸癌患者預后死亡的高危因素,是宮頸癌臨床治療及預后的潛在靶點。但本研究Linc00511高表達與低表達患者的中位生存時間均在5年以上,說明兩組患者預后情況均較佳,這可能與本研究納入的患者相對集中在TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期有關。

綜上所述,Linc00511在宮頸癌組織中呈高表達,表達水平與分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移有關,同時對宮頸癌患者的預后有一定價值,為宮頸癌的基因靶向治療提供新的思考方向。