吳娜 李淑君 康業(yè)斌

摘? 要：為了建立煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica）可視化快速檢測(cè)方法，試驗(yàn)以羥基萘酚藍(lán)（HNB）為指示劑，以煙草疫霉菌特異的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）為目的DNA片段，應(yīng)用LAMP設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4條引物，通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立一種準(zhǔn)確快速的LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的特異性、靈敏度及實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的煙草疫霉菌LAMP反應(yīng)體系具有較好特異性且靈敏度較高。特異性檢測(cè)只有煙草疫霉菌株LAMP產(chǎn)物為陽(yáng)性（藍(lán)色），且電泳結(jié)果能夠產(chǎn)生梯形條帶;靈敏度驗(yàn)證在DNA水平上可達(dá)到100 fg，是普通PCR檢測(cè)方法的1000倍。對(duì)田間疑似黑脛病病株及其根際土樣提取的DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，各有3份樣本為陽(yáng)性，且病株檢測(cè)結(jié)果與組織分離法對(duì)煙草疫霉的檢測(cè)結(jié)果相一致;接種2 d后，病害癥狀還不明顯的煙株中即可檢測(cè)到煙草疫霉菌。本研究建立的煙草疫霉LAMP檢測(cè)體系，可快速、簡(jiǎn)捷地檢測(cè)到病株及其攜帶土壤中的煙草疫霉菌。

關(guān)鍵詞：煙草疫霉菌;煙草黑脛病;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）;羥基萘酚藍(lán)（HNB）

Establishment of the Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection ofPhytophthora parasitica

WU Na¹， LI Shujun²， KANG Yebin^1*

（1. College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023， China; 2. Xuchang Tabocco Research Institute， Henan Academy of Agricultural Science， Xuchang， Henan 461000， China）

Abstract： In order to establish a rapid detection method forPhytophthora parasitica， hydroxynaphthol blue （HNB） was used as an indicator for thePhytophthora nicotianaspecific transcribed spacer （ITS） DNA sequence. The primers were designed with the LAMP design software. The LAMP reaction system and reaction conditions were optimized and? the specificity， sensitivity and practical application of the detection method were verified. The results showed that the LAMP reaction system ofPhytophthora nicotianaeestablished in this experiment has good specificity and high sensitivity. Specific detection showed that only the LAMP product of thePhytophthora nicotianastrain is positive （blue）， and the electrophoresis can produce trapezoidal bands. The sensitivity verification can reach 100 fg at the DNA level， which is 1000 times of the detection sensitivity of the common PCR method. The LAMP test was carried out on the DNA extracted from the suspected black smut disease strain and its rhizosphere soil samples， and each of the three samples were positive， and the test results of the diseased plants and the tissue separation method were consistent with the detection results ofPhytophthora nicotianae. After 2 days of inoculation，Phytophthora nicotianaecan be detected in tobacco plants with no obvious symptoms of tripping. ThePhytophthora nicotianaLAMP detection system established in this study can quickly and easily detect thePhytophthora nicotianaein the diseased plants and their carrying soil.

Keywords：Phytophthora parasitica; tobacco black shank; LAMP; HNB

煙草疫霉菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）為鞭毛菌亞門(mén)（Mastigomycotina）卵菌綱（Oomycota）、疫霉屬（Phytophthora）的一種土傳植物病原菌^[1]，由該菌侵染煙株引起的黑脛病是煙草的毀滅性病害之一，且該菌常與其他土傳病菌如根黑腐病菌（Thielaviois basicola）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、腐霉菌（Pythium phanidermatum）等混合侵染，田間發(fā)病癥狀相似，病害診斷困難^[2]。傳統(tǒng)的煙草病害診斷方法是對(duì)具有典型癥狀的病樣進(jìn)行分離、鑒定，其耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，易受人為及環(huán)境等諸多因素干擾^[3]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的煙草疫霉菌檢測(cè)方法已成為生產(chǎn)中迫切需要解決的問(wèn)題。目前煙草疫霉菌的分子檢測(cè)方法主要以普通PCR和熒光定量PCR為主^[4-5]，這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且需要特殊的儀器設(shè)備，無(wú)法滿(mǎn)足基層檢測(cè)的需求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等^[6]于2000年開(kāi)發(fā)的一種快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物（2條外引物和2條內(nèi)引物），利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒溫條件下高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增靶序列;LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可通過(guò)SYBR Green I、鈣黃綠素和羥基萘酚藍(lán)（HNB）等^[7-8]顯色劑染色后顏色變化來(lái)判斷，可方便、直觀(guān)地獲取反應(yīng)結(jié)果;目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于燕麥鐮孢菌^[9]、尖孢鐮孢菌^[10]、柑桔潰瘍病菌^[11]、煙草環(huán)斑病毒^[12]、香蕉穿孔線(xiàn)蟲(chóng)^[13]等植物病原物的檢測(cè)。有關(guān)LAMP技術(shù)在煙草疫霉菌檢測(cè)方面的報(bào)道較少，王勇等^[14]、陳慶河等^[15]利用SYBR Green I顯色劑建立了煙草疫霉菌的LAMP技術(shù)檢測(cè)體系，但SYBR Green I顯色劑需要在反應(yīng)結(jié)束后開(kāi)管添加，此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定^[16]。因此，本研究選擇羥基萘酚藍(lán)（HNB）做顯色劑，且在反應(yīng)液中提前加入HNB，以煙草疫霉特異的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）為目的DNA片段，設(shè)計(jì)4條引物，建立了LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、靈敏度、田間及接種病株的應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)估，以期為煙草疫霉菌的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1? 供試菌株

煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica）與對(duì)照菌株立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatm）、固執(zhí)腐霉（Pythium recalcitrans）、二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）均來(lái)自于河南科技大學(xué)植物病害分子鑒定與綠色防控實(shí)驗(yàn)室。

1.2? 菌株培養(yǎng)及基因組DNA的提取

將致病疫霉（Phytophthora infestans）轉(zhuǎn)至黑麥培養(yǎng)基^[17]，辣椒疫霉（Phytophthora capsici）轉(zhuǎn)至燕麥培養(yǎng)基（OA）^[18]，其他菌株轉(zhuǎn)至馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)4 d后，從菌落邊緣切取相應(yīng)菌絲塊，致病疫霉菌株轉(zhuǎn)至黑麥液體培養(yǎng)基，辣椒疫霉轉(zhuǎn)至燕麥液體培養(yǎng)基，其他菌株轉(zhuǎn)至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿。病原菌總DNA的提取采用CTAB法^[19]提取。采用植物基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程有限公司編號(hào)：B518231）進(jìn)行煙草組織DNA的提取。沒(méi)有發(fā)病的健康植株用作對(duì)照的煙株。提取的DNA保存在?20 ℃冰箱中備用。

1.3? 病原菌ITS序列的擴(kuò)增及LAMP引物的設(shè)計(jì)

從GeneBank中下載煙草疫霉菌的ITS基因序列和其他疫霉種的ITS基因序列，利用MEGA軟件對(duì)所有下載的ITS基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并使用在線(xiàn)應(yīng)用軟件Primer Explore V5 （http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），根據(jù)LAMP引物篩選原則篩選出一套特異性檢測(cè)引物。其中，F(xiàn)3/B3為外引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)引物，其序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，將合成好的引物放入D2012 Plus型臺(tái)式高速離心機(jī)（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），4000 r/min離心1 min，使吸附于離心管壁的引物沉到離心管底部。根據(jù)引物管壁標(biāo)簽的說(shuō)明，首先用ddH₂O將引物配制成100 μmol/L的保存液，?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前再將保存液稀釋至試?yàn)時(shí)所使用的濃度。

1.4 ?LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

試驗(yàn)參考Bst DNA polymerase推薦體系（dNTP 1.6 mmol/L，MgSO₄6 mmol/L，F(xiàn)IP/BIP各1.6 μmol/L，F(xiàn)3/B3各0.2 μmol/L，Bst DNA polymerase 320 U/mL，加2.5 μL的10×ThermoPol Buffer，1 μL模板DNA，滅菌水補(bǔ)至25 μL。64 ℃恒溫孵育1 h。）及相關(guān)文獻(xiàn)^[8-12]，通過(guò)單因素變化對(duì)LAMP反應(yīng)體系的各參數(shù)，包括HNB[源葉生物科技（上海）有限公司]與dNTP[生工生物工程（上海）股份有限公司]、Bst DNA聚合酶與硫酸鎂[威展生物科技（鄭州）有限公司]進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)選用HNB作為指示劑，若目的序列發(fā)生擴(kuò)增，則反應(yīng)液呈藍(lán)色（陽(yáng)性反應(yīng)），反之反應(yīng)液呈紫色（陰性反應(yīng)），最后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳再次驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)生階梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無(wú)此現(xiàn)象。設(shè)置3次重復(fù)。

1.5 ?LAMP引物特異性檢測(cè)

根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)所有供試菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)，通過(guò)肉眼觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)色為陽(yáng)性，紫色為陰性;并用2.0%瓊脂糖凝膠電泳加以驗(yàn)證。設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 ?LAMP檢測(cè)靈敏度測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)煙草疫霉DNA濃度后，按10倍梯度（10^-1～10^-7）稀釋為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL，分別取1 μL各梯度DNA稀釋液以進(jìn)行快速LAMP擴(kuò)增和普通PCR，比較LAMP檢測(cè)法和普通PCR檢測(cè)法對(duì)煙草疫霉的檢測(cè)靈敏度差別。普通PCR反應(yīng)引物使用基于ITS基因靶標(biāo)設(shè)計(jì)的煙草疫霉菌特異性引物F3/B3。普通PCR反應(yīng)的混合液總體積為25 μL，包括：相應(yīng)濃度的模板DNA，2×Taq Gold Master Mix Buffer 12.5 μL，F(xiàn)3/B3 0.5 μmol/L，ddH₂O 9 μL，PCR儀上完成反應(yīng)。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳1 h（80 V），在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。LAMP檢測(cè)結(jié)果直接用肉眼觀(guān)察，藍(lán)色為陽(yáng)性，紫色為陰性;并用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。設(shè)置3次重復(fù)。

1.7 ?田間病株與病土中煙草疫霉檢測(cè)

從洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣煙田采集具有煙草黑脛病疑似癥狀的病莖樣本5份，提取樣本總DNA，各取1 μL DNA用于LAMP檢測(cè)，同時(shí)對(duì)病株發(fā)病部位按照常規(guī)組織分離法進(jìn)行病菌分離驗(yàn)證。設(shè)置3次重復(fù)。

取上述5株疑似病株根際土壤5份，提取土壤樣本總DNA，取1 μL DNA用于LAMP檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與病株檢測(cè)結(jié)果相比較。設(shè)置3次重復(fù)。

1.8? 接種植株發(fā)病組織中煙草疫霉檢測(cè)

選長(zhǎng)勢(shì)良好的感黑脛病煙草品種長(zhǎng)脖黃（6～7片葉），用無(wú)菌注射器刺傷莖部表皮，在針刺部位接種菌齡7 d煙草疫霉菌絲塊（直徑為5 mm），用脫脂棉蘸取無(wú)菌水包裹保濕，以接種空白瓊脂塊的為對(duì)照。在接種1、2、3 d后分別取接種部位莖部組織約100 mg，提取植物侵染部位的總DNA，利用LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置3次重復(fù)。

2 ?結(jié)? 果

2.1 ?LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

2.1.1? HNB濃度的優(yōu)化? 圖1A顯示，HNB在0.1～0.2 mmol/L 6個(gè)不同的濃度下反應(yīng)液均變?yōu)樗{(lán)色，顏色逐漸變亮，確定0.2 mmol/L為HNB反應(yīng)濃度;由圖1B顯示，HNB濃度在0.1～0.2 mmol/L時(shí)電泳條帶差異不顯著。

2.1.2? dNTP濃度的優(yōu)化? 如圖2A所示，dNTP在1.0～1.6 mmol/L 4個(gè)不同的濃度下反應(yīng)液均變?yōu)樗{(lán)色，且顏色逐漸變深，當(dāng)dNTP濃度為1.4 mmol/L時(shí)，反應(yīng)液顏色最亮，確定1.4 mmol/L為dNTP反應(yīng)濃度;dNTP濃度在1.0～1.6 mmol/L時(shí)電泳條帶差異不顯著（圖2B）。

2.1.3? 硫酸鎂濃度的優(yōu)化? 硫酸鎂在3～7 mmol/L 5個(gè)不同的濃度下反應(yīng)液均變?yōu)樗{(lán)色（圖3A），顏色差異不顯著，通過(guò)參考Bst DNA polymerase推薦體系[威展生物科技（鄭州）有限公司]及相關(guān)文獻(xiàn)^[8-12]，確定6 mmol/L為硫酸鎂反應(yīng)濃度;硫酸鎂濃度為3～7 mmol/L時(shí)電泳條帶差異不顯著（圖3B）。

2.1.4? Bst DNA酶濃度的優(yōu)化? Bst DNA酶在240～ 320? U/mL 2個(gè)不同的濃度下反應(yīng)液均變?yōu)樗{(lán)色（圖4A），顏色逐漸變深，確定320 U/mL為Bst DNA酶反應(yīng)濃度;Bst DNA酶濃度在320 U/mL時(shí)電泳條帶最亮（圖4B）。

結(jié)合試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及參考Bst DNA polymerase推薦體系[威展生物科技（鄭州）有限公司]及相關(guān)文獻(xiàn)^[8-12]，優(yōu)化后的最終反應(yīng)體系各組分最佳濃度為：dNTP 1.4 mmol/L，MgSO₄6 mmol/L，HNB 0.2 mmol/L，F(xiàn)IP/BIP各1.6 μmol/L，F(xiàn)3/B3各0.2 μmol/L，Bst DNA polymerase 320 U/mL，加2.5 μL的10×ThermoPol Buffer，1 μL模板DNA，滅菌水補(bǔ)至25 μL。將上述25 μL反應(yīng)體系置于0.2 mL的PCR反應(yīng)管內(nèi)，輕微渦旋后將反應(yīng)管置于PCR儀上完成反應(yīng)。反應(yīng)程序：64 ℃擴(kuò)增60 min，80 ℃退火10 min。

2.2 ?引物特異性檢測(cè)

如圖5A所示，在HNB指示劑的作用下，只有煙草疫霉LAMP檢測(cè)顯示藍(lán)色;電泳結(jié)果顯示（圖5B）擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特有的梯形條帶，而其他供試菌株中均沒(méi)有觀(guān)察到這些現(xiàn)象。說(shuō)明LAMP引物對(duì)檢測(cè)煙草疫霉具有很好的特異性。

2.3 ?LAMP檢測(cè)靈敏度

LAMP檢測(cè)結(jié)果在以100 fg/μL DNA為模板時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物可顯示藍(lán)色（圖6A）。取5 μL LAMP產(chǎn)物用2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，從100 ng/μL至100 fg/μL的模板DNA都可以出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物特有的梯形條帶（圖6B），說(shuō)明該LAMP反應(yīng)體系可以檢測(cè)到100 fg的煙草疫霉基因組DNA。普通PCR以F3/B3為引物，模板DNA濃度在100 ng/μL至100 pg/μL時(shí)均可得到有效的擴(kuò)增（圖6C），表明其檢測(cè)的靈敏度為100 pg/μL。LAMP檢測(cè)靈敏度比普通PCR提高1000倍。

2.4 ?田間病株與病土中煙草疫霉LAMP檢測(cè)

通過(guò)對(duì)5份疑似煙草黑脛病病株的DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3份為陽(yáng)性，2份為陰性（圖7A）。病樣經(jīng)常規(guī)組織分離與分離物形態(tài)學(xué)觀(guān)察鑒定，僅陽(yáng)性病樣的分離物鑒定為煙草疫霉。5份疑似病株根際土壤的DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3份為陽(yáng)性，2份為陰性（圖7B），根際土壤檢測(cè)結(jié)果與煙株檢測(cè)結(jié)果一致。證實(shí)了本研究建立的LAMP檢測(cè)體系對(duì)煙草疫霉菌具有特異性。

2.5 ?接種植株發(fā)病組織中煙草疫霉LAMP檢測(cè)

感黑脛病品種長(zhǎng)脖黃接種1 d后，接種部位無(wú)明顯癥狀;2 d后接種部位縊縮，有少量褐色或黑色壞死斑，病斑不擴(kuò)展;3 d后接種部位明顯縊縮，莖部有褐色或黑色壞死，并上、下擴(kuò)展。接種2 d、3 d后的煙株，接種部位莖部組織均可檢測(cè)到煙草疫霉（圖8A、B）。證實(shí)本研究建立的LAMP檢測(cè)體系對(duì)煙草疫霉菌具有很高的靈敏性，可用于黑脛病的早期診斷。

3 ?討? 論

試驗(yàn)基于真菌ITS序列設(shè)計(jì)出一套用于檢測(cè)煙草疫霉的LAMP特異性引物，并對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)試劑使用濃度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了煙草疫霉LAMP檢測(cè)體系。

本研究利用HNB建立的煙草疫霉LAMP技術(shù)體系可以檢測(cè)到100 fg的煙草疫霉基因組DNA，檢測(cè)靈敏度比普通PCR提高1000倍;比劉萍花等^[20]建立的多重PCR檢測(cè)黑脛病菌靈敏度提高了100倍;比王勇等^[14]利用SYBR Green I建立的煙草疫霉快速檢測(cè)體系靈敏度提高了10倍，是陳慶河等^[15]利用SYBR Green I建立的煙草疫霉快速檢測(cè)體系靈敏度的0.1倍。趙賽^[21]報(bào)道在優(yōu)化濃度范圍內(nèi)，隨著dNTP濃度的加大，反應(yīng)條帶越來(lái)越清晰。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)反應(yīng)靈敏度影響最大的體系成分為dNTP，在優(yōu)化濃度范圍內(nèi)，隨著dNTP濃度增加，反應(yīng)液變化的顏色加深。此外，不同體系靈敏度產(chǎn)生的差異還與引物設(shè)計(jì)、染色劑種類(lèi)等因素有關(guān)。

在大田實(shí)際應(yīng)用中，本研究建立的LAMP檢測(cè)方法，所得的檢測(cè)結(jié)果與組織分離結(jié)果一致。較傳統(tǒng)組織分離鑒定植物病原物，LAMP技術(shù)更具有便捷、快速不受人為因素影響等優(yōu)點(diǎn)，且不受植物組織浸出液干擾^[22]，這對(duì)生產(chǎn)上診斷和防治煙草疫霉菌引起的相關(guān)病害具有重要的應(yīng)用價(jià)值。人工接種的結(jié)果證明，病菌侵入煙株2 d，在煙株猝倒癥狀還不明顯時(shí)即可被檢測(cè)到標(biāo)靶菌，這對(duì)于田間煙株早期檢測(cè)、病害早期預(yù)防有重要的實(shí)用價(jià)值。

4 ?結(jié)? 論

本研究建立的煙草疫霉LAMP檢測(cè)體系，能夠快速、準(zhǔn)確地從煙株發(fā)病組織及其根際土壤中檢測(cè)出煙草疫霉，這對(duì)制定煙草黑脛病的田間監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)防治具有重要的意義。

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