左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠行為學影響及神經(jīng)保護機制研究

王 睿 吳睦霖 王 偉 邢宇雙 常金龍

現(xiàn)代醫(yī)學認為，圍絕經(jīng)期抑郁癥是一種常見的由生物、社會及心理等共同作用的心境障礙性疾病，與遺傳、神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)、社會心理應激、神經(jīng)可塑性障礙等因素有關[1]。其中社會心理應激+低雌激素水平被認為是圍絕經(jīng)期抑郁癥主要致病原因。古代中醫(yī)認為，圍絕經(jīng)期抑郁癥為“情感失調(diào)、病位在腦、腎腦失濟”所致，其本質(zhì)為“腎陰虧虛、肝火亢盛、擾動心神”，即腎精不足影響腦的形態(tài)與功能，“腎精虧虛-腎腦失濟”是致病之本和主要病機[2]。

對于圍絕經(jīng)期抑郁癥治療，西醫(yī)臨床多基于抑郁癥“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏”學說，采用單用抗抑郁藥物，即三環(huán)及四環(huán)類抗抑郁藥(米帕明、氯米帕明、阿米替丁等)、選擇性5-HT再攝取抑制劑(氟西汀、帕羅西汀、舍曲林等)及單胺氧化酶抑制劑(異煙肼、氯丙胺等)，單用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)和激素+抗抑郁藥物治療。但因抗抑郁西藥“臨床效應時間滯后”現(xiàn)象、不良反應大及成癮性，孕激素耗竭維生素B6，雌激素(estrogen，E)致癌性(乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌)使其紛爭不斷。

“補腎健腦”是中醫(yī)臨床治療腦病特色療法。中藥以效應廣泛、毒性不良反應小、協(xié)同作用強特點，在圍絕經(jīng)期抑郁癥這種病因不清、致病危險因素多、發(fā)病機制復雜的情志疾病中具有獨特優(yōu)勢。中藥可通過“眾多顯效形式的單靶點疊加作用、多靶點協(xié)同作用及毒性分散效應”發(fā)揮藥效并削弱自身毒性[3]。

左歸丸出自《景岳全書·新八方陣》，為明代醫(yī)家張景岳“滋陰補腎，益精填髓”代表名方，主要由熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿角膠、龜板膠八味藥物組成，用于腎陰虛所致諸多癥狀[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，左歸丸具有神經(jīng)保護作用及植物雌激素活性，對腦損傷具有神經(jīng)保護作用，可緩解腎陰虛所致更年期綜合征等婦科疾病，可調(diào)節(jié)患者腎陰虧虛、肝血不足及情志失調(diào)引起的陰陽失衡[5～7]。本研究以圍絕經(jīng)期抑郁癥小鼠模型為研究對象，探討左歸丸抗圍絕經(jīng)期抑郁癥的神經(jīng)保護作用及機制，為臨床抗抑郁癥藥物研發(fā)提供新的方向。

材料與方法

1.材料：藥品與試劑：左歸丸(上海雷允上封浜制藥有限公司，批號151012)，鹽酸氟西汀膠囊(Fluoxetine，F(xiàn)LU，蘇州禮來制藥，批號2076AC)，戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥有限公司，批號258A2)，全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)，批號062916160817)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)，批號032516160711)，小鼠E2、5-HT、NE、DA 試劑盒購自北京誠林生物技術(shù)有限公司，批號分別為20180601、20170204、20170201、20170106，CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB、β-Actin、山羊抗兔IgG/HRP多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)公司，批號分別為999802W、99983F、14D526、9H124、AF11026274、AF12114126，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2.主要儀器：曠場反應箱(上海移數(shù)信息科技有限公司)，小鼠懸尾裝置(自制)，TECAN酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

3.實驗動物：清潔級雌性昆明小鼠，體質(zhì)量20±2g，購自齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(黑)2016-001。

4.動物模型制備、分組及給藥：OFT篩選評分相近小鼠60只，適應性飼養(yǎng)1周。根據(jù)SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件產(chǎn)生隨機數(shù)字分為6組，即假手術(shù)組、圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組、氟西汀+雌激素組(FLU+E2組，3mg/kg+0.15mg/kg)、左歸丸低、中、高劑量組(11.5mg/kg、23.0mg/kg、46.0mg/kg)，每組10只。小鼠飼養(yǎng)條件、圍絕經(jīng)期抑郁癥模型制備方法、卵巢切除術(shù)前及術(shù)后飼養(yǎng)方法、CUMS刺激方式參照文獻[8]。

5.曠場實驗(open filed test，OFT)：OFT可以檢測大、小鼠在新奇環(huán)境中的自主活動(水平運動得分)、探索活動(垂直運動得分)及緊張恐懼程度(糞便例數(shù))[8]。懸尾實驗(tail suspension test，TST)：TST最早由法國藥理學家Luscien Steru等根據(jù)“搜索-等待策略”原理建立，可用于評價和篩選抗抑郁藥物[9]。以上兩組實驗在應激第1天、第21天(9:00～11：00時)各測定1次，平行實驗并對測試者設盲，避免“希望效應”。

6.血清E2含量測定：行為學測試結(jié)束后，小鼠摘眼球，取血，4℃勻漿，2300r/min離心10min，靜止，吸取上清，-80℃保存。按照ELISA法試劑盒說明書進行操作，測定血清E2含量。腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定：行為學測試結(jié)束后取腦組織，ELISA法測定腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA及NE含量[10]。

7.海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB蛋白含量測定：采用Western blot法檢測蛋白表達。行為學測試結(jié)束后取腦海馬組織，投入液氮中研磨，經(jīng)蛋白抽提→定量→上樣(每孔上樣量20μg)→電泳(電壓100V、15min，進入分離膠后，電壓120V，90min)→濕法轉(zhuǎn)膜(100V，90min)→5%脫脂奶粉封閉→兔源一抗(CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB及β-actin抗體稀釋濃度分別為1∶800、1∶800、1∶800、1∶800及1∶1000)孵育(4℃、過夜)→山羊抗兔IgG/HRP(1∶2000)孵育(室溫，120min)→ECL顯色。采用目的條帶/內(nèi)參條帶吸光度作為結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1.左歸丸可改善圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠抑郁樣行為：(1)OFT：應激第1天，各實驗組小鼠水平運動及垂直運動得分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。應激第21天，與假手術(shù)組比較，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠OFT水平運動及垂直運動得分減少；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，可增加OFT水平運動及垂直運動得分；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量組較為明顯；差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。(2)TST：應激第1天，各實驗組小鼠懸尾不動時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。應激第21天，與假手術(shù)組比較，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠懸尾不動時間增加；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，小鼠懸尾不動時間減少；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量組較為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠行為學影響

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

2.左歸丸可增加圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠血清E2含量：與假手術(shù)組比較，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠血清E2含量減少；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，小鼠血清E2含量增加；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、E2含量影響

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

3.左歸丸可增加圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量：與假手術(shù)組比較，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠腦組織5-HT、NE、DA含量減少；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠比較，給予藥物治療后，腦組織5-HT、NE、DA含量增加；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

4.左歸丸可上調(diào)小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達：與假手術(shù)組比較，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達減少；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，給予各藥物治療后，可上調(diào)海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯；差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3，圖1)。

表3 左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠海馬組織主要蛋白表達影響

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

圖1 左歸丸對各組小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達影響A.假手術(shù)組；B.圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組；C.FLU+E2組；D.左歸丸低劑量組；E.左歸丸中劑量組；F.左歸丸高劑量組

討 論

圍絕經(jīng)期女性因社會心理應激敏感度增加，體內(nèi)雌激素水平下調(diào)致使抑郁癥高發(fā)?？挂钟粑魉?HRT為臨床治療圍絕經(jīng)期抑郁癥主要方法，但因藥物諸多不良反應面臨瓶頸。因此，從祖國醫(yī)學中尋求高效、低毒、具有神經(jīng)保護及抗抑郁作用中藥制劑具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究中筆者基于中醫(yī)“腎腦相關”理論，采用FLU+E2作為陽性對照藥物，采用OVX+CUMS法建立圍絕經(jīng)期抑郁癥小鼠模型，通過4個方面評價左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠行為學影響及神經(jīng)生物學機制[11]。

在圍絕經(jīng)期抑郁癥模型制備中，筆者采用小鼠雙側(cè)OVX方式模擬圍絕經(jīng)期“雌激素撤退”病因?qū)W說，采用CUMS方式模擬外界環(huán)境刺激，經(jīng)預實驗測試，結(jié)果顯示，圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠表現(xiàn)抑郁樣行為，使用左歸丸治療后，可改善各組小鼠抑郁樣行為。筆者不但驗證了復合模型能夠較大程度模擬圍絕經(jīng)期抑郁癥相似病因，說明模型制備是成功的；也證實了選用具有“滋陰補腎、填精益髓”、兼?zhèn)渲参锎萍に鼗钚缘淖髿w丸具有拮抗抑郁癥作用，筆者的研究進一步拓寬了左歸丸的藥用價值。

在闡明抑郁癥發(fā)病機制研究中，“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏”學說具有里程碑性質(zhì)的意義。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括5-HT、DA及NE，其代謝產(chǎn)物對神經(jīng)、內(nèi)分泌及心血管系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對情感、情緒及行為活動產(chǎn)生影響。臨床上抗抑郁癥藥物研發(fā)多基于此學說，通過多種途徑靶向增加突觸間隙單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量達到抗抑郁癥效果。基于此，筆者探討左歸丸對腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左歸丸可上調(diào)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。

“雌激素水平下降”是圍絕經(jīng)期抑郁癥患者獨有特征。雌激素為“天然的神經(jīng)營養(yǎng)因子”，可透過血腦屏障并在腦內(nèi)、外合成，可調(diào)節(jié)女性生殖功能、腦發(fā)育、突觸可塑性、學習記憶及認知功能，可通過抗炎、抗氧化應激、抑制神經(jīng)元凋亡、調(diào)控腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及受體信號通路、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子表達、通過γ-氨基丁酸(GABA)途徑調(diào)節(jié)HPA軸具有神經(jīng)保護作用?；诖?，筆者發(fā)現(xiàn)，左歸丸可增加圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠血清E2含量。

“海馬神經(jīng)可塑性障礙”是近年來抑郁癥病因?qū)W最具突破性理論。該學說認為，抑郁癥發(fā)生與海馬神經(jīng)可塑性失調(diào)密切相關[12]。神經(jīng)可塑性即腦可塑性，指中樞神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上的可修飾性，具體表現(xiàn)為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞損傷變化與神經(jīng)元內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)生障礙，主要包括神經(jīng)再生(樹突延伸、樹突棘密度變化、軸突生長、軸突發(fā)芽、突觸再生等)、突觸可塑性調(diào)節(jié)(長時稱增強、長時程抑制)等。CREB/BDNF信號通路被認為是海馬神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)關鍵信號因子，該信號通路相關蛋白表達與抑郁癥發(fā)生、發(fā)展關系密切，為各種信號蛋白信息轉(zhuǎn)導交匯點[13]?；诖?，筆者采用Westeron blot法檢測各組小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左歸丸可上調(diào)該信號通路CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達。

綜上所述，左歸丸對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠抑郁樣行為具有拮抗作用，其中以中劑量最為顯著。左歸丸腦保護作用的神經(jīng)生物學機制與上調(diào)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA含量、上調(diào)血清E2含量、上調(diào)CREB-BDNF/TrkB信號通路主要蛋白表達有關。