鎳對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)

石雅峰 龍辰 趙樅 李若群 閆春財(cái) 劉文彬

摘要??[目的]以紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）幼蟲為暴露對(duì)象，研究重金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的毒性及其對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響。[方法]采用急性毒性試驗(yàn)方法，計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用可見光法測(cè)定CAT活性，采用WST-1法測(cè)定SOD活性，采用比色法測(cè)定POD活性。[結(jié)果]重金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48、72、96 h LC50分別36.58、 12.36、2.21和0.66 mmol/L。鎳脅迫紅裸須搖蚊24 h后，各濃度組SOD和CAT活性均沒有顯著變化。48 h和72 h后，各濃度組與對(duì)照組存在顯著差異;96 h后，SOD活性僅在高濃度時(shí)表現(xiàn)為顯著增強(qiáng)的效應(yīng)，各濃度組CAT活性表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng)。

在24 h和48 h后，POD活性均沒有顯著變化，72 h后各濃度組POD活性呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，96 h后POD 活性逐步下降。[結(jié)論]CAT和SOD活性在急性暴露期受到顯著誘導(dǎo)，表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。POD活性表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞??紅裸須搖蚊;重金屬鎳;急性毒性試驗(yàn);抗氧化酶

中圖分類號(hào)??X??174文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

文章編號(hào)??0517-6611（2020）04-0084-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Toxic Effects of Nickel Exposure on Propsilocerus akamusi Larva

SHI Ya-feng，LONG Chen，ZHAO Cong et al??（College of Life Sciences，Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract??[Objective] To investigate the toxicity of heavy metal Ni to the larvae of Propsilocerus akamusi and its influences on the antioxidant enzymes system with P.akamusi as exposure object.[Method] Using acute toxicicity test method，the medium lethal concentration （LC50） was calculated by using SPSS software.The protein content was determined by Coomassie Brilliant Blue G-250 method，CAT activity was determined by visible light method，SOD activity was determined by WST-1 method，and POD activity was determined by colorimetry.[Result]LC50 of heavy metal nickel to 4-instar larva of P.akamusi for 24，48，72 and 96 h were 36.58，12.36，2.21，and 0.66 mmol/L，respectively.There was no significant change in SOD and CAT activities after Nickel exposure to P.akamusi larvae 24 h. After 48 and 72 h， there were significant differences between each concentration group and the control group.After 96 h，SOD activity was only significantly enhanced at high concentrations，while CAT activity was enhanced in each concentration group. POD activity showed no significant change after 24 h and 48 h，and POD activity ?in each concentration group ?showed an enhanced trend after 72 h and POD activity gradually decreased after 96 h.[Conclusion]The activities of CAT and SOD were significantly induced during acute exposure，showing similar changes.POD activity presented an first decreasing and then increasing trend.

Key words??Propsilocerus akamusi;Heavy metal Nickel;Acute toxicity test;Antioxidant enzymes

在過去的幾十年里，有毒重金屬導(dǎo)致的水體污染引起了人們的廣泛關(guān)注[1-3]，與有機(jī)污染物不同的是重金屬污染物無法被生物降解、具有很強(qiáng)的生物富集效應(yīng)且對(duì)土壤的污染不可逆，對(duì)環(huán)境有較大的破壞力[4]。鎳是一種在自然界中廣泛存在的重金屬，鎳和鎳化合物有較高的生產(chǎn)價(jià)值，比如鎳礦的開采和提純、電鍍和鎳鎘電池的生產(chǎn)等[5]。工業(yè)化進(jìn)程加重了水生生態(tài)系統(tǒng)的重金屬污染狀況。在常規(guī)水體環(huán)境中，Ni2+濃度為1～10 μg/L，但在一些嚴(yán)重污染的水體中鎳的排放量會(huì)增加50～100倍[6]。

搖蚊幼蟲是典型的水生無脊椎動(dòng)物，主要生活于淡水水域的底棲環(huán)境中，不僅是經(jīng)濟(jì)魚類的餌料，而且是水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)良好的指示生物[7]。紅裸須搖蚊幼蟲抗逆性強(qiáng)、易于獲取、價(jià)格低廉，具有廣闊的市場前景。目前對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的毒理學(xué)研究主要集中在重金屬銅、鉻、汞等、農(nóng)藥及其他有機(jī)污染物方面，以單一或復(fù)合污染物暴露的方式開展急性和慢性毒性試驗(yàn)，并對(duì)污染物脅迫下抗氧化酶系和解毒酶系的活性水平進(jìn)行了廣泛深入的研究[8-10]。此外，在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)方面也取得了一定的進(jìn)展[11]。

動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶系，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等是抗氧化應(yīng)激的第一道防線，可以在個(gè)體遭遇不良環(huán)境時(shí)，清除體內(nèi)不斷產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，從而使個(gè)體耐受性增強(qiáng)。關(guān)于逆境脅迫下紅裸須搖蚊幼

蟲體內(nèi)酶活性的變化，耿飛飛等[8]研究發(fā)現(xiàn)紅裸須搖蚊對(duì)Hg2+脅迫的敏感性較強(qiáng)，Hg2+刺激后其體內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GST）都有顯著變化。鄭先云等[12]研究發(fā)現(xiàn)紅裸須搖蚊對(duì)Cd2+脅迫的敏感性較低，在Cd2+短時(shí)間作用下CAT活性沒有顯著變化。

綜上可知，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)重金屬Cd2+、Cd2+、Hg2+及多種有機(jī)物的毒性試驗(yàn)[13-14]已取得較大進(jìn)展，但Ni2+脅迫下紅裸須搖蚊的毒性效應(yīng)研究較少涉及。筆者探究紅裸須搖蚊體內(nèi)不同抗氧化酶對(duì)重金屬鎳的響應(yīng)水平，旨在為紅裸須搖蚊的生物監(jiān)測(cè)及Ni2+的排放標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步揭示Ni2+對(duì)水生無脊椎動(dòng)物的毒性作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。

1??材料與方法

1.1??材料

紅裸須搖蚊幼蟲購于天津花鳥魚蟲市場，以頭殼寬度鑒定齡期，選取活性較高、體長一致的4齡搖蚊幼蟲作為試驗(yàn)材料。幼蟲的平均體重為（0.017±0.004）g，平均體長為（0.95±0.11）cm。在開始試驗(yàn)前，幼蟲用曝氣除氯48 h的自來水（pH 8.2，溶解氧含量7.7～9.6 mg/L，總硬度7.1 mmol/L，水體溫度20 ℃）在自然光照下馴養(yǎng)7 d，試驗(yàn)期間每天換水1次，每天多次監(jiān)測(cè)水質(zhì)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)異常時(shí)及時(shí)換水并將死亡的搖蚊幼蟲挑出，直至幼蟲的自然死亡率穩(wěn)定且小于1%時(shí)開展試驗(yàn)，馴養(yǎng)期間水體持續(xù)曝氣，幼蟲采用饑餓處理。

氯化鎳（NiCl2·6H2O），由天津市津科精細(xì)化工研究所提供。過氧化物酶（POD）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、過氧化氫（CAT）試劑盒、Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2??方法

1.2.1??重金屬的急性毒性試驗(yàn)。

試驗(yàn)依據(jù)《化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn)》國家標(biāo)準(zhǔn)[15]以及OECD[16]等相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)范。采用靜水染毒法進(jìn)行毒性測(cè)定，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用蒸餾水等比例配制成鎳離子濃度分別為4.21、8.42、16.84、33.68、67.36 mmol/L的5個(gè)劑量組，在200 mL燒杯中進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)容器中放入50只搖蚊幼蟲并以蒸餾水作為空白對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期間不投喂餌料。在試驗(yàn)開始后24、48、72、96 h，觀察并記錄紅裸須搖蚊幼蟲的存活情況及活動(dòng)狀態(tài)。用玻璃棒以中等力度觸碰搖蚊幼蟲腹部5～6節(jié)處，若搖蚊幼蟲未出現(xiàn)蜷縮運(yùn)動(dòng)則視為死亡。

1.2.2??酶活的測(cè)定。

1.2.2.1??酶液的制備。在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以96 h LC50為參照，設(shè)置0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mmo/L的鎳離子濃度梯度進(jìn)行急性暴露試驗(yàn)。在暴露24、48、72、96 h時(shí)取不同Ni2+濃度脅迫下存活的搖蚊幼蟲12只，各濃度組和對(duì)照組均進(jìn)行3次重復(fù)，取出的搖蚊幼蟲用濾紙吸干體表水分，按照1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，在冰水浴條件下用研磨棒將搖蚊幼蟲研磨成10%的組織勻漿，2 500 r/mi下離心10 min后，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2??酶活測(cè)定方法。嚴(yán)格按照SOD、POD、CAT試劑盒所標(biāo)示的方法測(cè)定酶活，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用可見光法測(cè)定CAT活性，采用WST-1法測(cè)定SOD活性，采用比色法測(cè)定POD活性。

1.2.3??數(shù)據(jù)處理。

采用SPSS軟件中的Probit模塊計(jì)算紅裸須搖蚊在不同濃度、不同時(shí)間處理下的半數(shù)致死濃度（LC50）、線性回歸方程、95%置信區(qū)間和相關(guān)系數(shù)。采用ANOVA方差分析進(jìn)行LSD多重比較，分析同一時(shí)間不同濃度以及不同時(shí)間相同濃度條件處理下各種酶活的變化。

2??結(jié)果與分析

2.1??紅裸須搖蚊幼蟲的中毒表現(xiàn)

接觸重金屬鎳溶液初期，試驗(yàn)組搖蚊幼蟲活動(dòng)劇烈，出現(xiàn)蟲體間纏繞的現(xiàn)象;暴露24 h后，各濃度組幼蟲活動(dòng)情況與對(duì)照組均無顯著差異，但體色由紅色變?yōu)槠攸S色;暴露48～72 h時(shí)，各濃度組搖蚊幼蟲活力顯著降低，處于靜止?fàn)顟B(tài)，但觸碰活體搖蚊幼蟲腹部仍能觀察到蜷縮反應(yīng)，對(duì)照組搖蚊自由游動(dòng)。暴露96 h后，觀察到死亡的紅裸須搖蚊幼蟲身體發(fā)黑變軟，漂浮于溶液表面。

2.2??金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的急性毒性

由表1可知，重金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48、72、96 h的LC50分別為36.58、 12.36、2.21和0.66 mmol/L。

2.3??紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化酶對(duì)Ni2+的脅迫響應(yīng)

2.3.1??鎳脅迫對(duì)紅裸須幼蟲不同暴露時(shí)間蛋白質(zhì)含量的影響。

由表2可知，24 h時(shí)，低濃度組的鎳離子對(duì)蛋白質(zhì)含量無顯著影響，而高濃度組會(huì)使蛋白質(zhì)含量顯著降低，當(dāng)鎳離子達(dá)到最高濃度（1.6 mmol/L）時(shí)蛋白質(zhì)含量降至（35.35±0.18） g/L。48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，高濃度組的蛋白質(zhì)含量存在顯著變化，而其余組別與對(duì)照組無明顯差異。72 h時(shí)，隨著Ni2+濃度的增大，Ni2+誘導(dǎo)蛋白質(zhì)含量升高的作用增強(qiáng)。96 h時(shí)，與對(duì)照組相比，各濃度組蛋白質(zhì)含量均顯著升高。由此可見，高濃度的鎳短時(shí)間內(nèi)可對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的靶標(biāo)酶產(chǎn)生抑制作用，但隨著作用時(shí)間的延長，體內(nèi)其他靶標(biāo)酶被誘導(dǎo)增強(qiáng)，提高了蛋白質(zhì)濃度。

2.3.2??鎳脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)抗氧化酶活性的影響。

紅裸須搖蚊幼蟲在不同濃度梯度的Ni2+脅迫24、48、72、96 h后體內(nèi)抗氧化酶活性的變化見表3。

2.3.3??鎳脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD活性的影響。

如圖1所示，鎳脅迫紅裸須搖蚊24 h時(shí)，各濃度組的SOD活性與對(duì)照組相比沒有顯著變化。48 h后，各濃度組的SOD活性均顯著升高，當(dāng)Ni2+濃度為1.6 mmol/L時(shí)SOD活性達(dá)到最大值。72 h，在0.80 mmol/L的Ni2+脅迫下SOD受到的誘導(dǎo)程度最大，為（76.75±0.005） U/mg。96 h，SOD活性在高濃度時(shí)顯著下降，但SOD活性仍高于對(duì)照組。

2.3.4??鎳脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)CAT活性的影響。由圖2可知，24 h時(shí)各濃度組CAT活性無顯著變化;48 h時(shí)，Ni2+濃度分別為0.2、0.4、0.8 mmol/L的試驗(yàn)組CAT活性顯著增強(qiáng)（P<0.01）。72和96 h，各濃度組CAT活性均極顯著升高（P<0.01）。72 h，各濃度組CAT活性均高于對(duì)照組;96 h，CAT活性相對(duì)于72 h時(shí)有所下降，但始終高于對(duì)照組。

2.3.5

鎳脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)POD活性的影響。從圖3可以看出，24、48 h時(shí)各濃度組POD活性與對(duì)照組相比無明顯變化;72 h，POD活性明顯下降（P<0.01）;96 h，POD活性顯著增強(qiáng)（P<0.01）。POD活性整體上呈現(xiàn)出前期無明顯變化、中后期先下降后上升的變化趨勢(shì)。

3??討論

通過急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊4齡幼蟲24、48 h的LC50分別為36.58和12.36 mmol/L，與閆賓萍等[17]研究鎳對(duì)羽搖蚊幼蟲的急性毒性結(jié)果相比，紅裸須搖蚊幼蟲比羽搖蚊幼蟲對(duì)鎳有更強(qiáng)的耐受性。Wentsel等[18]的研究結(jié)果為搖蚊具有較強(qiáng)耐受重金屬的能力提供了數(shù)據(jù)支撐。

近年來，大量研究結(jié)果表明，抗氧化酶活性可作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。該試驗(yàn)通過鎳對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲進(jìn)行24、48、72、96 h的急性暴露試驗(yàn)，監(jiān)測(cè)幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性的變化，進(jìn)而揭示環(huán)境水體中重金屬鎳的生物響應(yīng)情況。該試驗(yàn)結(jié)果表明，短時(shí)間內(nèi)紅裸須搖蚊幼蟲對(duì)鎳的敏感程度低，隨著作用時(shí)間的延長，SOD活性呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的SOD用來消除鎳對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲的活性損傷，96 h后氧自由基減少，SOD活性又逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。CAT活性的變化趨勢(shì)與SOD活性大致相同，但96 h后CAT活性仍被顯著誘導(dǎo)，用來清除SOD作用氧自由基后產(chǎn)生的H2O2。72 h后，各濃度組POD活性與對(duì)照組相比顯著降低，但96 h POD活性又逐漸回升至顯著高于對(duì)照組的水平。

綜上所述，重金屬鎳對(duì)紅裸須搖蚊體內(nèi)抗氧化酶活性有較大影響，CAT、SOD和POD活性均可作為監(jiān)測(cè)重金屬鎳對(duì)環(huán)境影響的指標(biāo)，CAT活性與SOD活性具有相同的變化趨勢(shì)，但CAT活性的變化響應(yīng)在SOD活性之后表現(xiàn)出協(xié)同作用。

POD活性呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)，有可能是CAT、SOD活性的顯著增強(qiáng)抑制了POD的活性，隨著作用時(shí)間的延長，SOD活性在逐步減弱的同時(shí)，POD活性顯著上升。然而，此變化的分子機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]

RAI P K.Heavy metal phytoremediation from aquatic ecosystems with special reference to macrophytes[J].Critical reviews in environmental science and technology，2009，39（9）：697-753.

[2] 張建江，賈繼民，馬永紅.中國重要水系的有毒重金屬污染狀況[J].職業(yè)與健康，2011，27（1）：89-91.

[3] 朱賢英.論有毒重金屬污染對(duì)人體健康的危害及飲水安全[J].湖北教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23（2）：72-74.

[4] NAGAJYOTI P C，LEE K D，SREEKANTH T V M.Heavy metals，occurrence and toxicity for plants：A review[J].Environmental chemistry letters，2010，8（3）：199-216.

[5] 陳素秋.鎳的性質(zhì)及用途[J].重有色冶煉，1980（10）：59-62.

[6] EISLER R.Nickel hazards to fish，wildlife，and invertebrates：A synoptic review[R].Patuxent Wildlife Research Center，1998.

[7] ARMITAGE P D，CRANSTON P S，PINDER L C V.The Chironomidae.The biology and ecology of non-biting midges[M].London：Chapman and Hall，1995.

[8] 耿飛飛，于洪賢，劉曼紅，等.汞脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化酶活性的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，46（4）：97-100.

[9] 葛士林，曹傳旺，王志英.3種農(nóng)藥對(duì)紅裸須搖蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和AChE活性的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（1）：108-109，126.

[10] 李浩.銅和鎘對(duì)羽搖蚊幼蟲（Chironomus plumosus）和紅裸須搖蚊幼蟲（Propsilocerus akamusi）的毒性效應(yīng)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[11] ZHENG X Y，XIE Z Y，WANG S，et al.Determination of the protein expression profiles of Propsilocerus akamusi（Tokunaga） Malpighian tubules response to cadmium stress by iTRAQ coupled LC-MS/MS[J].Journal of proteomics，2017，164：85-93.

[12] 鄭先云，龍文敏，郭亞平，等.Cd2+對(duì)紅裸須搖蚊Propsilocerus akamusi的急性毒性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（1）：86-91.

[13] CAO C W，LI X P，GE S L，et al.Enzymatic activities as potential stress biomarkers of two substituted benzene compounds in Propsilocerus akamusi （Diptera：Chironomidae）[J].Africa journal of aquatic socience，2012，37（3）：265-270.

[14] 趙燕，湯保華，蔡磊明，等.殺菌劑戊唑醇對(duì)花翅搖蚊（Chironomus kiiensis）幼蟲的急性毒性和抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J].農(nóng)藥，2012，51（6）：445-448.

[15] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn) 加標(biāo)于沉積物法：GB/T 27859—2011[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[16] OECD.Guideline 235：Chirnomus sp.，Acute Immobilisation Test [S].Paris：OECD，2004

[17] 閆賓萍，宋志慧.Ni2+、Hg2+和五氯酚對(duì)羽搖蚊（Chironomus plumosus）幼蟲的毒性和生物濃縮[J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，27（5）：411-414.

[18] WENTSEL R，MCINTOSH A，ATCHISON G.Evidence of resistance to metals in larvae of the midge Chironomus tentans in a metal contaminated lake[J].Bulletin of environmental contamination and toxicology，1978，20（4）：451-455.