蔡昭煒 趙 麗 何少娟 李雪玲

1.廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院(523326)；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院

弱精癥是導(dǎo)致男性不育癥的主要因素之一[1-2]，引起弱精癥的病因多種多樣，其發(fā)病機制仍是困擾生殖學(xué)術(shù)界的一大難題[3-4]。已有多個研究報道，男性精液中的蛋白質(zhì)主要由SEMG1基因編碼的蛋白構(gòu)成，主要參與精液凝膠基質(zhì)的構(gòu)成，對射精前的精子起到固定保護作用，射精時凝膠被前列腺特異抗原PSA酶分解，使精子從基質(zhì)中釋放出來，這就是精子液化過程[5-6]。當(dāng)SEMG1基因表達異常升高時，會造成精子液化效率低下，使精子數(shù)量和活力降低導(dǎo)致不育癥發(fā)生[7]。本研究通過分析弱精癥患者精子SEMG1基因表達及體外受精結(jié)局，探討SEMG1基因?qū)δ行圆挥Y中的影響，為闡明弱精癥的生物學(xué)機制提供理論支持，也為弱精癥的診斷標(biāo)志物和男性避孕藥物的開發(fā)提供新的啟發(fā)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月-2019年1月在東莞市第三人民醫(yī)院生殖中心就診的34例男性不育患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①自愿簽署知情同意書；②經(jīng)過檢查后分別確診為患輕度弱精癥、中重度弱精癥及未患弱精癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并性功能障礙史；②合并生殖器創(chuàng)傷史；③合并遺傳疾病或精神疾??；④合并睪丸及輸精管結(jié)扎術(shù)史。本研究通過了東莞市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

34例患者均在禁欲2～7d后采集精液，依據(jù)WHO第5版《人類精液檢查與處理的實驗室手冊》[8]標(biāo)準(zhǔn)檢測標(biāo)本，獲取精液常規(guī)分析的精子濃度、總數(shù)以及前向運動精子百分率的測量值。計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析儀選用美國哈密爾頓精子質(zhì)量分析儀。采用Percoll不連續(xù)梯度法處理精液，收集沉淀精子提取RNA，進一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測精子SEMG1基因表達，引物序列見表1。RNA提取試劑盒Maxima Reverse Transcriptase均購自德國Qiagen公司，LightCycler480型熒光定量PCR儀購自美國Roche公司。獲取患者體外受精結(jié)局。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 精子常規(guī)參數(shù)

34例年齡22～50歲，根據(jù)精子活力(PR)值分為非弱精12例(≥32%)，輕度弱精10例(20%～32%)，中重度弱精12例(0～20%)。各組精液常規(guī)參數(shù)見表2。

表2 各組精液常規(guī)參數(shù)比較

2.2 PCR檢測精子SEMG1基因表達

檢測結(jié)果顯示，精子SEMG1的基因表達輕度弱精癥組高于非弱精組，中重度弱精癥高于輕度弱精癥組(P<0.0001，圖1)(1720頁)。

2.3 免疫熒光染色檢測精子SEMG1蛋白表達

結(jié)果顯示，精子SEMG1蛋白表，中重度弱精癥組最高，輕度弱精癥次之，非弱精組最低(P<0.05，圖2)(1720頁)。

2.4 SEMG1表達水平與體外受精結(jié)局

分別對不同體外受精結(jié)局患者的精子SEMG1基因和蛋白表達進行分析:在基因水平，體外受精<50%的精子SEMG1表達高于體外受精≥50%的精子(P<0.0001，圖3a)(1720頁)；蛋白水平也同樣趨勢，免疫熒光結(jié)果顯示，體外受精<50%的精子SEMG1的蛋白表達水平高于體外受精≥50%的精子(P<0.0001，圖3b)(1720頁)。

3 討論

弱精癥是導(dǎo)致男性不育的主要因素之一。張國暉[9]等分別從基因突變、線粒體DNA突變、miRNA調(diào)控異常以及精子端粒長度改變等4個方面，綜述了目前對于弱精癥發(fā)病機制的認識現(xiàn)狀,弱精癥發(fā)病機制仍需更多探索。由SEMG1基因編碼的精原蛋白在附睪中高度表達，是影響射精精子凝膠包埋的主要蛋白，這些蛋白質(zhì)共有的抗原表位位于精子的運動部位[10-12]。在精液液化過程中，激肽釋放酶相關(guān)肽酶3(KLK3，又稱前列腺特異性抗原)將精原蛋白降解為低分子量片段，凝膠溶解，精子被釋放并逐漸運動[10-13]?？梢奡EMG1及其編碼的蛋白是調(diào)控精子液化、運動和活力的因素。有研究指出，SEMG1基因有望成為診斷弱精癥的潛在候選基因之一，這更加說明SEMG1基因與弱精癥間具有密切的相關(guān)性。

本研究輕度弱精癥男性精子SEMG1基因表達高于非弱精癥男性，中重度弱精癥者SEMG1基因表達最高，故認為隨著弱精癥病情加劇， SEMG1基因表達與病情程度成正相關(guān)，導(dǎo)致體外受精成功率降低，提示精子SEMG1在基因水平上調(diào)導(dǎo)致其蛋白表達水平的升高。此外，SEMG1蛋白也同樣，弱精癥較重患者其精子SEMG1蛋白表達升高，說明在蛋白水平弱精癥患者精子SEMG1的表達較非弱精癥者顯著升高，且與病情呈正相關(guān)。郭小彬[3]等通過高表達大鼠SEMG1基因成功建立了弱精癥大鼠模型；喬素冬[13]通過對比正常男性和弱精癥男性發(fā)現(xiàn)，SEMG1基因在弱精癥男性精子中表達明顯上調(diào)。SEMG1基因廣泛表達在射精精子中，同時在睪丸、附睪和前列腺中也有少量表達。精原蛋白1是構(gòu)成精液凝膠的主要成分，凝膠狀精子不具備運動活力[14-16]，當(dāng)精原蛋白1與前列腺分泌的Zn2+結(jié)合后，前列腺抗原被激活進而分解凝膠精子中的精原蛋白1，產(chǎn)生具有抑制精子活性和抗菌活性的小分子多肽片段[11]。精子的活性與液化是影響精子獲能的必要因素，是精子實現(xiàn)向前運動的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)與上述文獻報道一致。

文獻報道和本研究均發(fā)現(xiàn)SEMG1表達上調(diào)可導(dǎo)致精子運動能力下降，那么SEMG1的高表達是否會影響精子與卵子的結(jié)合成為弱精癥男性不育的致病因素？本次研究分別檢測了不同受精結(jié)局者精子SEMG1基因和蛋白的表達。結(jié)果表明，在體外受精受精結(jié)局<50%的精子中，SEMG1基因和蛋白的表達均高于體外受精結(jié)局≥50%的精子，說明高表達SEMG1基因的精子不僅是造成男性精子活力降低導(dǎo)致弱精癥的因素，同時也會降低體外受精成功率，這為解釋弱精癥男性高發(fā)不育癥提供了一定的實驗室指標(biāo)依據(jù)。

綜上所述，弱精癥男性精子SEMG1基因表達異常升高影響精子液化導(dǎo)致精子活力降低，進而抑制精子與卵子的結(jié)合最終造成弱精癥男性不育癥。這為解釋弱精癥的發(fā)病和治療提供了靶點，同時也為潛在避孕節(jié)育開發(fā)靶點提供思路。