駱駝?wù)颇z原蛋白提取工藝優(yōu)化與性能分析

宋 樂,王英麗,吉日木圖

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000)

膠原蛋白是動物組織中的一種纖維狀蛋白質(zhì),是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,占動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的30%左右[1],對機(jī)體和臟器起著支持、保護(hù)、結(jié)合與形成間隔作用,其特征結(jié)構(gòu)是三螺旋結(jié)構(gòu),使膠原蛋白保持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu),同時還具有良好的生物相容性、可降解性和低抗原性等[2]。因此,膠原蛋白作為可食性或可降解膠原膜[3]、促進(jìn)肌肉組織愈合的傷口敷料[4]、保健食品等被廣泛應(yīng)用于皮革、制藥、生物醫(yī)學(xué)與食品等行業(yè)領(lǐng)域中。目前國內(nèi)對水產(chǎn)動物等膠原資源關(guān)注點(diǎn)較多,但其提取獲得的膠原蛋白存在熱穩(wěn)定性與生物力學(xué)性能差等問題,在一定程度上限制其應(yīng)用[5-6]。此外,牛、羊、豬的皮、跟腱等也是膠原蛋白提取的主要來源,而對駱駝資源膠原蛋白的研究則較少。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是國內(nèi)主要的養(yǎng)駝基地之一,據(jù)中國統(tǒng)計年鑒顯示,2018年我國約有32.3萬峰雙峰駝,我區(qū)約有16.9萬峰。駱駝肉、乳、皮、絨與骨均具一定經(jīng)濟(jì)價值,其胎盤、乳、脂、瘤胃內(nèi)容物等部位科研價值極高[7]。相關(guān)研究表明,駱駝?wù)茽I養(yǎng)價值高,富含膠原蛋白,是豐富的膠原蛋白潛在資源[8]。駱駝?wù)苽鹘y(tǒng)加工的方式主要以烹調(diào)為主,為擴(kuò)大駱駝?wù)频睦梅秶?增加駱駝的附加值,本文以駱駝?wù)茷閷嶒炘?選用胃蛋白酶從駱駝?wù)浦刑崛∧z原蛋白,確定其最佳提取工藝參數(shù)。經(jīng)過鹽析純化后,獲得駱駝?wù)颇z原蛋白粗品,并與牛蹄膠原蛋白進(jìn)行性質(zhì)比較,以期為動物膠原蛋白資源的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮駱駝?wù)?購于阿拉善盟左旗屠宰場,剔骨洗凈在-20 ℃下冷藏備用;羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、牛蹄膠原蛋白 北京索萊寶生物科技有限公司;胃蛋白酶(1∶10000;800～2500 U/mg) 美國Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 上海伯樂(Bio-Rad)公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JJ-2組織搗碎機(jī) 常州賽普實驗儀器廠;78-1磁力加熱攪拌器 常州迅生儀器有限公司;鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;SP-723P可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;2XZ-2型旋片式真空泵 臨海市永昊真空設(shè)備有限公司;紫外可見分光光度計 日立高新技術(shù)公司;BPHJS-060A高低溫交變濕熱試驗箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原蛋白提取工藝 新鮮冷凍駱駝?wù)啤A(yù)處理→酶解→離心→鹽析→離心→透析→冷凍干燥→膠原蛋白

將解凍后的駱駝?wù)萍舫尚K,在10%正丁醇中浸泡脫脂24 h,離心后棄上清,沉淀去除表面的正丁醇。隨后浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中24 h,以除去雜蛋白,堿處理后的駱駝?wù)朴萌ルx子水沖洗至中性備用。取脫脂除雜蛋白后的樣品,以一定的料液比(w/v)加入乙酸溶液,再加入一定量的胃蛋白酶酶解反應(yīng)一定時間,10000 r/min離心20 min,保留上清酶解液,測定其膠原蛋白含量。在離心所得上清酶液中加入NaCl至最終濃度為0.9 mol/L進(jìn)行鹽析,取沉淀用0.5 mol/L乙酸溶解后,依次在0.1 mol/L的乙酸溶液和蒸餾水中透析24 h,每6 h更換一次透析外液,離心后進(jìn)行冷凍干燥得粗品膠原蛋白,妥善保存[9]。膠原蛋白提取所有操作在低于10 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.2 單因素實驗 以駱駝?wù)颇z原蛋白提取率為指標(biāo),采用1.2.1的方法,固定提取時間為36 h,加酶量3%,乙酸濃度0.50 mol/L,料液比為1∶15 g/mL進(jìn)行實驗。

設(shè)定變量因素的水平依次為提取時間(12、24、36、48、60、72 h)、加酶量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)、乙酸濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mol/L)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)進(jìn)行單因素實驗。

1.2.3 正交試驗 在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上,以提取時間、加酶量、乙酸濃度、料液比為影響因素,各取三個水平,采用L9(34)正交試驗設(shè)計,以膠原蛋白提取率為指標(biāo),確定駱駝?wù)颇z原蛋白的最優(yōu)提取工藝。駱駝?wù)颇z原蛋白的試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 膠原蛋白提取率 采用比色法[10]測定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。羥脯氨酸質(zhì)量濃度范圍0～2 μg/mL,以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得方程Y=0.1935X+0.0318(R2=0.9997)。

按照1.2.1的方法進(jìn)行提取,移取離心后的上清酶解液1 mL,加入3 mL的6 mol/L鹽酸在105 ℃下完全水解5 h[11],用分光光度法測定酶解液中羥脯氨酸含量,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)合式(1)與式(2),計算膠原蛋白的含量并計算其提取率。

膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×7.1

式(1)

式(2)

式中:X表示酶解液中膠原蛋白含量,μg/mL;Y表示原料中膠原蛋白的含量,為99.63 μg/mL;7.1為羥脯氨酸換等成膠原蛋白系數(shù)。

1.2.5 紫外光譜掃描 取最優(yōu)條件下制備的粗品膠原蛋白,用0.5 mol/L的乙酸配制0.5 mg/mL的膠原蛋白溶液[12],用紫外分光光度計在波長200～400 nm進(jìn)行掃描,波長間隔為1 nm,蒸餾水作空白對照。

1.2.6 SDS-PAGE分析 將樣品以0.5 mg/mL的濃度溶于0.5 mol/L的乙酸溶液,混合物與上樣緩沖液混勻后于100 ℃的水浴加熱3～5 min,冷卻后以10 μL上樣量進(jìn)行上樣。采用8%的分離膠和5%的濃縮膠[13]。直壓恒流電源,濃縮膠80 V,進(jìn)入分離膠后調(diào)整為120 V,電泳時間為2～3 h。

1.2.7 吸油性分析 準(zhǔn)確量取2 mL食用級花生油,放置于5 mL刻度離心管中,再稱取0.3 g樣品(駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白),加入離心管中,用細(xì)棒攪拌1 min,靜置30 min,在轉(zhuǎn)速為10000 r/min離心10 min,記下游離油的體積[14],則樣品的吸油性為:

式(3)

1.2.8 吸濕性分析 精確稱取樣品0.5 g(駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白),置于干燥的稱量瓶中,放入密閉恒溫恒濕培養(yǎng)箱,溫度為30 ℃,濕度為80%,每隔一段時間精確測定樣品的質(zhì)量,同時用甘油作對照,重復(fù)做3組平行試驗[15-16],計算樣品和甘油的吸濕率,以時間為橫坐標(biāo),吸濕率為縱坐標(biāo)作圖。吸濕率計算公式如下:

式(4)

式中:X表示吸濕率,%;mt表示t小時后樣品或甘油的質(zhì)量,g;m0表示試驗開始時樣品或甘油的質(zhì)量,g。

1.2.9 保濕性分析 精確稱取樣品0.5 g(駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白),置于稱量瓶中,同時在稱量瓶中加入樣品質(zhì)量的10%蒸餾水,放入含有干燥劑的密閉干燥器中,每隔一段時間精確測定樣品的質(zhì)量,同時用甘油作對照[15-16],重復(fù)做3組平行試驗,計算樣品和甘油的保濕率,以時間為橫坐標(biāo),保濕率為縱坐標(biāo)作圖。保濕率計算公式如下:

式(5)

式中:Y表示保濕率,%;m0表示試驗開始時樣品或甘油的質(zhì)量,g;mt表示t小時后樣品或甘油的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)3次,采用Excel 2013和Graphpad-Prism 6.01進(jìn)行作圖,用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響 由圖1可知,隨著提取時間的延長,駱駝?wù)颇z原蛋白的提取率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(P<0.05),在提取時間為48 h時,駱駝?wù)颇z原蛋白提取率達(dá)到最高,這表明隨著提取時間的延長,駱駝?wù)浦心z原蛋白與胃蛋白酶充分接觸,利于駱駝?wù)浦心z原蛋白溶出。當(dāng)提取時間超過48 h時,提取液中膠原蛋白達(dá)到飽和狀態(tài),隨著提取時間繼續(xù)延長,膠原蛋白含量顯著下降(P<0.05),這可能是因為提取出來的膠原蛋白部分被胃蛋白酶酶解,此測定結(jié)果與宋正規(guī)等[17]結(jié)果一致。由此,試驗初步選擇駱駝?wù)颇z原蛋白提取時間范圍為24～48 h。

圖1 提取時間對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on collagen yield of camel palm注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

2.1.2 加酶量對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響 由圖2可以看出,隨著胃蛋白酶加酶量的增加,駱駝?wù)颇z原蛋白提取率呈先升后降趨勢(P<0.05)。胃蛋白酶加酶量從1%增至5%時,膠原蛋白提取率增長速度較快,當(dāng)超過5%時,可能是由底物不足影響反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行,增加加酶量,提取率不再增長,而加酶量過高,可能會過度酶解,使小分子的蛋白片段斷鏈為游離的氨基酸,導(dǎo)致膠原蛋白提取率顯著下降[18-19],因此,初步選擇駱駝?wù)颇z原蛋白提取加酶量的范圍為3%～5%。

圖2 加酶量對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on collagen yield of camel palm

2.1.3 乙酸濃度對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響 由圖3可知,隨著乙酸濃度的增加,駱駝?wù)颇z原蛋白的提取率也增加,在濃度超過1.00 mol/L時,提取率開始顯著下降(P<0.05),可能因為乙酸濃度過高,駱駝?wù)频鞍追€(wěn)定性下降,膠原蛋白肽鏈極易斷鏈,產(chǎn)生大量的肽鏈片段[20],導(dǎo)致膠原蛋白的提取率下降,因此,初步選擇駱駝?wù)颇z原蛋白提取的乙酸濃度為0.50～1.00 mol/L。

圖3 乙酸濃度對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of acetic acid concentration on collagen yield of camel palm

2.1.4 料液比對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響 由圖4所示,駱駝?wù)颇z原蛋白的提取率受料液比影響較大(P<0.05)。隨著料液比的增大,駱駝?wù)颇z原蛋白的提取率呈顯著提高的趨勢。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/mL時,駱駝?wù)颇z原蛋白提取率最高,繼續(xù)增大料液比,提取率沒有顯著變化,因此,初步選擇駱駝?wù)颇z原蛋白提取的料液比為1∶15～1∶25 g/mL。

2.2 駱駝?wù)颇z原蛋白提取工藝優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合表2和表3可知,提取時間、加酶量、乙酸濃度、料液比對駱駝?wù)颇z原蛋白的提取率均有極顯著影響,其中提取時間影響最大,乙酸濃度影響最小。正交試驗優(yōu)化駱駝?wù)颇z原蛋白的提取工藝有兩種組合,即A3B2C1D1(D2),按照兩種工藝組合做驗證試驗,結(jié)果表明兩種方案的提取率相近,沒有顯著差異,考慮到試驗成本,故選取方案:A3B2C1D1,即提取時間48 h,加酶量4%,乙酸濃度0.50 mol/L,料液比1∶15 g/mL,此條件下提取率為30.33%±0.19%。

表3 主體間效應(yīng)的檢驗Table 3 Test of intersubject effect

圖4 料液比對駱駝?wù)颇z原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on collagen yield of camel palm

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.3 紫外掃描圖譜分析

由于膠原蛋白中存在羰基、羧基和酰胺基等發(fā)色基團(tuán),使其能吸收一定波長的紫外光。一般來說,芳香族氨基酸殘基會在250～280 nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰;氨基酸殘基、氫鍵或與螺旋等構(gòu)象相關(guān)的次級鍵會在210～250 nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰;蛋白質(zhì)分子中的肽鍵及某些與蛋白質(zhì)構(gòu)象相關(guān)因素會在210 nm波長以下范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰[21-22]。由圖5可知,駱駝?wù)颇z原蛋白的最大吸收峰出現(xiàn)在232 nm處,與相關(guān)研究的結(jié)果相近[23-24],是膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰,可初步判定本試驗的提取物為膠原蛋白。

圖5 駱駝?wù)颇z原蛋白的紫外掃描圖譜Fig.5 Ultraviolet scan of collagen of camel paw

2.4 SDS-PAGE圖譜分析

由圖6所示,與Marker對比,駱駝?wù)颇z原蛋白中含有1條β鏈和至少2條α鏈,在高于250 kDa處的條帶是Ⅰ型膠原蛋白α鏈的三聚體,即γ鏈;在200 kDa處是α鏈二聚體,即β鏈;130 kDa處為α1鏈;約110 kDa處是α2鏈,與王曉軍等[23]結(jié)果一致。因此,判斷提取物為結(jié)構(gòu)較為完整的Ⅰ型膠原蛋白。研究表明,高分子質(zhì)量的γ和β鏈含量越高,膠原蛋白的凝膠強(qiáng)度就越低[25],駱駝?wù)颇z原蛋白的γ和β鏈含量較少,表明駱駝?wù)颇z原蛋白的凝膠性較好。駱駝?wù)颇z原蛋白的α1帶的強(qiáng)度約為α2帶的2倍,表明駱駝?wù)颇z原蛋白分子可能由兩條α1鏈和一條α2鏈構(gòu)成,而由于α1-和α3-在單相垂直電泳中無法分離,α1鏈中可能含有α3鏈[26],因此駱駝?wù)颇z原蛋白分子也可能由α1鏈、α2鏈和α3鏈各一條構(gòu)成[27]。

圖6 SDS-PAGE凝膠電泳分析圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of collagen

2.5 駱駝?wù)颇z原蛋白、牛蹄膠原蛋白的吸油性對比分析

駱駝?wù)频鞍踪|(zhì)與牛蹄蛋白質(zhì)含量相近,且市面上的哺乳動物膠原蛋白產(chǎn)品多來源于牛蹄,由此試驗選擇牛蹄膠原蛋白比較分析駱駝?wù)颇z原蛋白的性能。駱駝?wù)颇z原蛋白吸油性測定結(jié)果表明,駱駝?wù)颇z原蛋白的吸油值為(6.22±0.44) mL/g,同時測得牛蹄膠原蛋白的吸油值為(10.68±0.26) mL/g,駱駝?wù)颇z原蛋白的吸油性弱于牛蹄膠原蛋白的吸油性。

2.6 駱駝?wù)颇z原蛋白、牛蹄膠原蛋白的吸濕性和保濕性對比分析

膠原蛋白富含親水性的甘氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等天然保濕因子,性質(zhì)溫和,不刺激皮膚和眼睛,它與皮膚表面的蛋白質(zhì)結(jié)合,可補(bǔ)充人體流失的膠原蛋白、氨基酸,能涵養(yǎng)皮膚水分,使皮膚有良好的親合性[28]。從圖7和圖8可看出,隨著時間延長,駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白的吸濕率和保濕率曲線變化相似。與甘油的吸濕率和保濕率對比,駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白明顯均弱于甘油,且駱駝?wù)颇z原蛋白的吸濕性和保濕性均比牛蹄膠原蛋白好。當(dāng)放置達(dá)到48 h時駱駝?wù)颇z原蛋白與牛蹄膠原蛋白的吸濕率分別為8.15%和5.79%,其保濕率分別為50.15%和43.17%。膠原蛋白的吸濕率和保濕率與其暴露的親水基團(tuán)有關(guān)[29],由上述試驗結(jié)果可推測出駱駝?wù)颇z原蛋白和牛蹄膠原蛋白的親水基團(tuán)存在差異。

圖7 駱駝?wù)颇z原蛋白、牛蹄膠原蛋白和甘油的吸濕性曲線Fig.7 Hygroscopic curve of camel palm collagen,bovine tendon collagen and glycerol

圖8 駱駝?wù)颇z原蛋白、牛蹄膠原蛋白和甘油的保濕性曲線Fig.8 Moisture retention curve of camel palm collagen,bovine tendon collagen and glycerol

3 結(jié)論

本試驗優(yōu)化駱駝?wù)颇z原蛋白的提取工藝最優(yōu)組合為提取時間48 h、胃蛋白酶加酶量為4%、乙酸濃度為0.50 mol/L、料液比為1∶15 g/mL,得到駱駝?wù)颇z原蛋白提取率為30.33%±0.19%。通過紫外光譜、垂直電泳分析駱駝?wù)颇z原蛋白的最大吸收峰為232 nm,符合I型膠原蛋白特征,且含有α1、α2、β鏈,保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。與牛蹄膠原蛋白相比,試驗結(jié)果顯示駱駝?wù)颇z原蛋白的吸濕性和保濕性優(yōu)于牛蹄膠原蛋白,且其吸油性弱于牛蹄膠原蛋白。為駱駝?wù)颇z原蛋白的研究應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ),但如何更高效的提取駱駝?wù)颇z原蛋白,進(jìn)一步研究其功能特性及應(yīng)用范圍,這些問題的解決將成為未來駱駝?wù)颇z原蛋白研究的重點(diǎn)。