洪 鑫，韓 成，孔 帆，周豐武，吳少松，鐘文輝①，劉 標

(1.南京師范大學地理科學學院江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京師范大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210023；3.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所國家環(huán)境保護生物安全重點實驗室，江蘇 南京 210042)

復合性狀轉(zhuǎn)基因作物包含多個外源基因的轉(zhuǎn)入，外源基因間或其與植物原有基因間可能存在關(guān)聯(lián)、非關(guān)聯(lián)和代謝等作用，改變蛋白質(zhì)的表達水平，對生物產(chǎn)生不利影響或?qū)е缕渌穷A期反應，加大復合性狀轉(zhuǎn)基因作物對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的潛在風險[1]。姜偉麗等[2]研究發(fā)現(xiàn)抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因棉花田中刺吸式害蟲數(shù)量顯著低于Bt棉田害蟲數(shù)量。在轉(zhuǎn)基因作物生長過程中，外源基因表達產(chǎn)物主要通過植株殘體(含花粉)和根系分泌物進入土壤[3]。植物根系生長伴隨整個作物季，外源基因表達產(chǎn)物將會直接與根際土壤環(huán)境接觸，吸附或結(jié)合在黏土顆粒、腐殖質(zhì)組分或有機礦物復合物表面并在土壤中積累，從而影響土壤微生物群落變化[4]。江帆等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米雄穗的CP4 EPSPS蛋白表達量比耐除草劑玉米顯著高31.6%，而抗蟲玉米葉片中Cry1Ac蛋白表達量比抗蟲耐除草劑玉米顯著高129%，在噴施多倍草甘膦的條件下，抗蟲耐除草劑玉米與耐除草劑玉米株高無顯著差異，但是均顯著高于抗蟲玉米?？梢姡D(zhuǎn)基因作物種植可能會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。另外，多種外源基因轉(zhuǎn)入可改變作物代謝途徑，其根系分泌物組成及含量也會發(fā)生變化，并影響根際微生物群落。據(jù)報道，轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因棉花比親本棉花能分泌更多的賴氨酸和甲硫氨酸，而轉(zhuǎn)Bt基因棉花與其親本相比，根系分泌物組成相同，但是酪氨酸、亮氨酸等含量有顯著差異[6]。目前，大部分研究者主要集中關(guān)注單一性狀轉(zhuǎn)基因作物對土壤根際微生物的影響[7]，復合性狀轉(zhuǎn)基因作物如何影響根際土壤微生物群落的報道鮮見。

土壤酶活性與土壤微生物活性密切相關(guān)，在催化有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮重要作用，常常被用作衡量微生物活性和土壤肥力的指標[8]。熒光素二乙酸酯(FDA)水解酶是土壤中能催化水解FDA的一類非專一性酶，包括蛋白酶、酯酶和脂肪酶等，其與土壤微生物活性、土壤各養(yǎng)分指標均顯著相關(guān)，能夠很好地反映土壤微生物活性和有機質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]，因而被廣泛應用于土壤質(zhì)量評價。以往報道常采用平板培養(yǎng)[10]、變性梯度凝膠電泳[11]等技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響；而平板培養(yǎng)技術(shù)僅能研究土壤微生物中的極少部分，變性梯度凝膠電泳技術(shù)也有檢出限低的缺點，不能全面評價微生物群落。近年來，定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)具有實時、準確等特點，高通量測序技術(shù)能全面解析復雜土壤樣品中微生物群落，在土壤微生物學和生物安全研究領(lǐng)域得到廣泛應用[12]。

該研究基于溫室微區(qū)實驗，采集抗蟲耐除草劑復合性狀轉(zhuǎn)基因玉米“雙抗12-6”及其非轉(zhuǎn)基因親本玉米“鄭單958”拔節(jié)期和成熟期根際土壤，測定土壤FDA水解酶活性以表征土壤微生物活性，采用定量PCR、Illumina Hiseq高通量測序技術(shù)分析根際土壤細菌和真菌群落豐度、組成和多樣性，研究抗蟲耐除草劑復合性狀轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤細菌和真菌群落的影響。上述研究結(jié)果可為抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米風險評估提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 玉米微區(qū)種植及根際土壤采集

選用轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和G10evo-spsps基因抗蟲耐除草劑玉米“雙抗12-6”(GM)及非轉(zhuǎn)基因玉米品種“鄭單958”(CK)，種植于南京師范大學仙林校區(qū)溫室微區(qū)內(nèi)，微區(qū)由1 m×1 m×0.5 m混凝土筑成，處理間留有0.5 m隔離帶，各重復之間設(shè)置0.1 m厚隔層，每個處理設(shè)置4個重復，每個微區(qū)種植4株玉米，微區(qū)內(nèi)隨機填充旱地土壤。供試土壤填充前采用風干、粉碎、機械研磨和機械混勻等方式確保土壤均勻，并采用四分法采集4份土壤測定土壤基本理化性質(zhì)，保存于-20 ℃條件下。供試土壤預處理前所測理化性質(zhì)、微生物活性及數(shù)量的變異系數(shù)范圍為0.3%～4.8%，土壤均一性較好。玉米種植期為2018年5月至8月，以玉米幼苗破土記為0 d，共生長105 d。溫室內(nèi)設(shè)置降溫系統(tǒng)，控制室溫為18～35 ℃。玉米種植前每個微區(qū)施基肥(包括發(fā)酵后雞糞1 kg，復合肥60 g)并混勻，生長期根據(jù)每周玉米長勢施肥(共施復合肥240 g、尿素390 g)，平均每2 d澆水1次。于玉米幼苗破土10 d后，使用試劑盒(QuickStixTMKIT forCry1AbCorn Leaf & Seed， EnviroLogix，USA)法檢測玉米苗外源蛋白表達狀況，確保供試轉(zhuǎn)基因玉米具有外源蛋白表達且非轉(zhuǎn)基因玉米無外源蛋白表達。

于玉米生長60 d時拔節(jié)期(營養(yǎng)生長代表時期，S1)、105 d時成熟期(生殖生長代表時期，S2)選取長勢一致的玉米植株進行破壞性采樣，收集根際土壤[13]。土壤樣品及時分離過篩，一部分土壤存于4 ℃條件下，用于土壤理化性質(zhì)和微生物活性指標測定；一部分土壤于-80 ℃條件下保存，用于微生物群落測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)和FDA水解酶測定

土壤pH按w(土)∶V(水)=1∶2.5搖勻靜置后測定；土壤有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測定；土壤速效鉀含量采用乙酸銨-原子吸收法測定；土壤全氮含量采用開氏消煮法[12]測定；土壤有機碳和可溶性有機碳含量采用TOC自動分析儀(Shimadzu TOC-L，Japan)[14]測定。FDA水解酶采用熒光素比色法[15]測定。

1.3 土壤總DNA提取及微生物豐度測定

每個土壤樣品稱取0.5 g鮮土，采用試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil，MP，Biomedicals， USA)法提取土壤總DNA。采用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo，USA)測定DNA溶液的純度和濃度，DNA溶液于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定土壤細菌16S rRNA基因和真菌ITS基因豐度分別表征細菌和真菌群落豐度。細菌16S rRNA基因擴增采用引物對515F(5′-GTGNCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/926R(5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′)[16]，反應體系體積為20.0 μL，包含10.0 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq、0.3 μL上下游引物、1.0 μL稀釋10倍后DNA樣品和8.4 μL滅菌超純水。反應程序為：95 ℃預變性，3 min；40個循環(huán)(95 ℃變性10 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s)，每輪循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù)，并采用溶解曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性；采用含有16S rRNA基因的濃度為6.53×102～6.53×108copies·μL-1的標準質(zhì)粒構(gòu)建標準曲線，擴增效率為85.3%(R2為0.994)。真菌ITS基因擴增采用引物對ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)/ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[17]，反應體系體積為20.0 μL，包含10.0 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq、0.3 μL上下游引物、1.0 μL稀釋10倍后DNA樣品和8.4 μL滅菌超純水。反應程序為：95 ℃預變性，5 min；40個循環(huán)(95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù)，并采用溶解曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性；采用含有ITS基因的濃度為1.83×102～1.83×108copies·μL-1的標準質(zhì)粒構(gòu)建標準曲線，擴增效率為101.5%(R2為0.994)。每個樣品共3個技術(shù)重復并設(shè)置陰性對照。

1.4 高通量測序分析

采用515F/926R和ITS1F/ITS2R分別對細菌16S rRNA基因V4 + V5區(qū)和真菌ITS基因ITS1區(qū)進行擴增，并委托廣東美格基因科技有限公司完成高通量測序。測序采用Illumina Hiseq 2500測序平臺，利用雙末端測序Paire-end方法，從每條序列的5′和3′端產(chǎn)生250 bp的reads，對原始數(shù)據(jù)進行處理獲得有效數(shù)據(jù)；將PE reads拼接成Tags，再次過濾獲得目標片段，通過QIIME[18]平臺在97%相似水平上對OTU進行分類，并基于Silva[19]和UNITE[20]數(shù)據(jù)庫分別對16S rRNA基因和ITS基因進行OTU分類注釋。

細菌樣品共獲得411 226條有效序列數(shù)，CK處理S1和S2時期各獲得22 695～28 405和23 266～36 758條有效序列數(shù)，GM處理S1和S2時期分別獲得16 007～25 165和21 634～29 628條有效序列數(shù)。真菌樣品共獲得1 519 764條有效序列數(shù)，CK處理S1和S2時期分別獲得75 391～105 131和94 265～133 401條有效序列數(shù)，GM處理S1和S2時期分別獲得70 194～90 973和86 665～104 663條有效序列數(shù)。選取細菌和真菌群落的門、屬數(shù)量以及Chao1、Shannon指數(shù)分別表征細菌和真菌群落的α多樣性；采用Bray-Curtis距離和多變量統(tǒng)計學方法主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)比較不同樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)差異；選取門、屬水平上相對豐度大于1%的細菌和真菌群落分析其群落組成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件(IBM，USA)進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差(Tukey檢驗，P<0.05，n=4)分析比較不同樣品間土壤理化性質(zhì)、微生物活性、豐度和多樣性的差異；采用雙因素方差(Tukey檢驗)分析比較玉米品種或生長時期對土壤理化性質(zhì)、微生物群落活性、多樣性和門水平上群落組成差異的影響力大小。采用獨立樣本t檢驗分析比較玉米品種或生長時期屬水平上微生物群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性及數(shù)量的影響

根際土壤pH約為7.2，呈中性。單因素方差分析顯示，GM處理S2時期根際土壤DOC含量比GM處理S1時期顯著高40.1%(P<0.05)，S1時期GM和CK處理土壤C/N比值比S2時期2個處理顯著提高17.2%和19.3%(P<0.05)，與CK處理相比，GM處理均未顯著影響土壤C/N比值和DOC含量；4個處理間根際土壤pH，TOC、TN、AP和AK含量均無顯著差異。雙因素方差分析顯示，玉米品種未顯著影響土壤理化性質(zhì)，但生長時期顯著影響根際土壤DOC(P< 0.01)、TN含量(P<0.01)和C/N比值(P<0.001)；根際土壤AP含量(P<0.05)顯著受到玉米品種和生長時期的交叉影響。根際土壤FDA水解酶活性為5.24～6.81 μg·g-1·h-1，細菌16S rRNA基因豐度為6.26×1010～7.65×1010copies·g-1，真菌ITS基因豐度為2.72×108～5.20×108copies·g-1。單因素方差分析顯示，根際土壤FDA水解酶活性、細菌16S rRNA基因和真菌ITS基因豐度在各處理間均無顯著差異。雙因素方差分析顯示，細菌16S rRNA基因豐度顯著受生長時期影響(P<0.05)，F(xiàn)DA水解酶活性和真菌ITS基因豐度未顯著受到玉米品種或生長時期的影響(表1)。

表1 玉米根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性和數(shù)量

Table 1 Maize rhizospheric soil physicochemical properties, microbial activity and community abundance

數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(n=4)。同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示2個生長時期不同處理間某指標顯著差異，ND表示未測定，分析方法為單因素方差分析(Tukey檢驗)，P<0.05，n=4。采用雙因素方差分析(Tukey檢驗)對不同品種處理和不同時期之間做比較分析，其中，F(xiàn)為膨脹系數(shù)，表示影響力大小。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。A為豐度，B為細菌16S rRNA基因，C為真菌ITS基因，D為FDA水解酶活性。

2.2 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤細菌及真菌群落α多樣性的影響

細菌群落在門和屬水平上分類的有效數(shù)量分別為27～29和251～264。單因素方差分析顯示，CK處理S1時期細菌群落門、屬水平上的數(shù)量均顯著高于GM處理S2時期(P<0.05)；GM處理S1時期Shannon指數(shù)顯著高于CK處理S2時期(P<0.05)；細菌群落Chao1指數(shù)在各處理間無顯著差異。雙因素方差分析顯示，細菌群落門(P<0.01)和屬(P<0.05)水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)(P<0.05)、Shannon指數(shù)(P<0.01)均顯著受生長時期的獨立影響。真菌群落在門和屬水平上分類的有效數(shù)量分別為6～7和156～179。單因素方差分析顯示，真菌群落門和屬水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)在各處理間均無顯著差異。雙因素方差分析顯示，真菌群落門和屬水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)均未顯著受玉米品種或生長時期的影響(表2)。

2.3 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤細菌和真菌群落β多樣性的影響

細菌群落PCoA分析見圖1(a)。第1和2主坐標解釋度分別為55.27%和13.59%，樣品在第1、2主坐標排序中聚成2組，GM處理S1時期和CK處理S1時期聚成1組，GM處理S2時期和CK處理S2時期聚成1組，2組的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.178和0.180(P>0.05)，說明GM處理S1時期和CK處理S1時期之間、GM處理S2時期和CK處理S2時期之間群落結(jié)構(gòu)相似。GM處理S1和S2時期、CK處理S1和S2時期的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.420和0.556(P< 0.05)，說明GM處理S1和S2時期之間、CK處理S1和S2時期之間的群落結(jié)構(gòu)差異顯著。真菌群落PCoA分析見圖1(b)。第1、2主坐標解釋度分別為60.70%和12.02%，樣品在第1、2主坐標排序中均沒有聚類，S1時期GM和CK處理、S2時期GM和CK處理、CK處理S1和S2時期以及GM處理S1和S2時期的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.277、0.081、0.126和0.213(P>0.05)，說明各處理真菌群落結(jié)構(gòu)相似。

表2 玉米根際土壤細菌和真菌群落α多樣性

Table 2 Community diversity of bacteria and fungi in maize rhizosphere soils

處理細菌16S rRNA基因真菌ITS基因PGChao1指數(shù)Shannon指數(shù)PGChao1指數(shù)Shannon指數(shù)GM_S129±0ab256±2ab1 567±34a7.56±0.18a6±0a179±5a936±26a5.03±0.63aCK_S128±0a264±3a1 572±26a7.43±0.21ab6±0a156±11a865±38a3.67±0.81aGM_S227±0b251±3b1 479±60a5.95±0.64ab6±0a158±8a902±41a3.65±0.76aCK_S227±0ab253±1ab1 431±50a5.73±0.43b7±0a170±9a863±37a4.39±0.54a品種0.2733.3660.2470.1780.4290.4022.2980.199時期11.000??8.087?6.588?16.232??0.4290.1200.2640.229品種×時期0.0911.0180.3570.0103.8574.0720.1912.292

數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤差(n=4)。同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示2個生長時期不同處理間某指標顯著差異，分析方法為單因素方差分析(Tukey檢驗)，P<0.05，n=4。采用雙因素方差分析(Tukey檢驗)對不同品種處理和不同時期之間做比較分析，其中，F(xiàn)為膨脹系數(shù)，表示影響力大小。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。P和G為門水平上和屬水平上分類的有效數(shù)量。

RAdonis為非參數(shù)多因素方差分析(nonparametric MANOVA)指數(shù)，基于Bray-Curtis距離計算得到；*表示2個處理間差異顯著。

2.4 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤細菌和真菌群落組成的影響

共獲取12個門水平上相對豐度大于1%的細菌類群，有奇古菌門(Thaumarchaeota)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria) 5個優(yōu)勢細菌群落，占總細菌群落的80%以上〔圖2(a)〕。其中，奇古菌門相對豐度最高，占總細菌群落的13.9%～44.6%。其次是變形菌門，其相對豐度占總細菌群落的17.9%～31.0%。雙因素方差分析顯示，放線菌門顯著受玉米品種或生長時期的獨立影響；奇古菌門、變形菌門、酸桿菌門等均顯著受生長時期的獨立影響。共獲取3個門水平上相對豐度大于1%的真菌類群，其中，子囊菌門(Ascomycota)相對豐度占總真菌群落的38%～73%〔圖2(b)〕。雙因素方差分析顯示，子囊菌門、擔子菌門(Basidiomycota) 未顯著受玉米品種或生長時期的獨立影響；接合菌門(Zygomycota)受玉米品種和生長時期的交叉影響。

選取細菌屬水平上相對豐度大于1%且變化量絕對值總和位居前10位的物種進行獨立樣本t檢驗分析(表3)。表3顯示，S1時期GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對豐度比CK處理顯著降低0.98%；S2時期GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對豐度比CK處理顯著降低6.02%；其中，Marmoricola是放線菌門屬水平上相對豐度變化最大的物種，在S1和S2時期，GM處理Marmoricola相對豐度分別比CK處理高1.46%和1.03%。CK處理S2時期Candidatus_Nitrocosmicus、Candidatus_Nitrososphaera相對豐度分別比S1時期顯著升高20.76%和6.09%，而CK處理S2時期MND1、Sphingomonas、Flavisolibacter等相對豐度顯著低于S1時期。

*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

表3 屬水平上細菌和真菌相對豐度變化量

Table 3 Changes in relative abundance of bacterial and fungal taxa at the genus level

界屬名稱相對豐度變化量/%GM_S1-CK_S1GM_S2-CK_S2CK_S2-CK_S1GM_S2-GM_S1細菌Candidatus_Nitrocosmicus-2.320.2520.76?23.33?Candidatus_Nitrososphaera-0.98?-6.02?6.09?1.05?Marmoricola1.461.03-1.31?-1.74MND10.230.69-2.39?-1.93?Sphingomonas-0.200.71-2.27??-1.37Flavisolibacter-0.910.36-1.48??-0.21Nitrospira-0.810.03-1.40??-0.56Luteimonas0.160.50-0.83?-0.50Ramlibacter0.090.19-0.66???-0.56?Chryseolinea0.110.24-0.60??-0.47真菌Fusarium1.22?-2.212.78?-0.65Staphylotrichum0.91??-0.540.49-0.96??Lophiostoma-0.25-0.004??-0.25-0.01

采用獨立樣本t檢驗對各處理做比較分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。如GM_S1-CK_S1表示S1時期GM處理屬水平相對豐度減去CK處理屬水平相對豐度。

GM處理S2時期Candidatus_Nitrocosmicus、Candidatus_Nitrososphaera相對豐度分別比S1時期顯著升高23.33%和1.05%，而GM處理S2時期MND1、Ramlibacter相對豐度顯著低于S1時期。選取真菌屬水平上相對豐度大于1%的物種進行獨立樣本t檢驗分析(表3)。S1時期GM處理Fusarium、Staphylotrichum相對豐度顯著高于CK處理。S2時期GM處理Lophiostoma相對豐度顯著低于CK處理。CK處理S2時期Fusarium相對豐度顯著高于S1時期。GM處理S2時期Staphylotrichum相對豐度顯著低于S1時期。

3 討論

3.1 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤微生物活性的影響

FDA水解酶能夠很好地反映土壤微生物活性和土壤質(zhì)量變化，是土壤生物學重要指標之一[21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著改變根際土壤理化性質(zhì)和FDA水解酶活性，成熟期根際土壤可溶性有機碳和全氮含量顯著高于拔節(jié)期根際土壤(表1)。孫彩霞等[22]通過短期種植轉(zhuǎn)Bt基因水稻和棉花，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因性狀均未顯著影響土壤全碳、全氮和速效磷等理化性質(zhì)，筆者研究結(jié)果與之相似。景小鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因玉米相比，轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤全氮含量，但是在特定時期會顯著影響根際土壤有機質(zhì)、全磷等其他理化性質(zhì)。SUN等[4]研究指出轉(zhuǎn)Bt基因棉花組織可能會刺激土壤微生物活性，從而使土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶、纖維素酶活性普遍提高。SHEN等[24]研究表明轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花的根際土壤脲酶和蛋白酶活性等沒有顯著差異，筆者研究結(jié)果與之有相似之處。筆者研究認為在玉米種植過程中追施尿素和復合肥，可能是導致玉米成熟期根際土壤可溶性有機碳和全氮含量顯著高于拔節(jié)期的主要原因。

3.2 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤細菌群落的影響

細菌最多可占土壤微生物總量的90%，是土壤微生物組成中最大的類群，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的作用至關(guān)重要[25]。根際土壤細菌群落非常敏感，可能受作物種類、植株生長時期和耕種管理方式等生物和非生物因素的影響[26]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤細菌群落豐度和多樣性，而生長時期對細菌群落豐度和多樣性有顯著影響(表1)。劉凱等[27]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤細菌、氨化細菌和好氧性固氮菌數(shù)量。BARRIUSO等[28]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米與親本玉米根際細菌豐度和豐富度均無顯著差異，對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小，而植物生長時期或環(huán)境因素可能對微生物群落產(chǎn)生更顯著的影響。GRIFFITHS等[29]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米對土壤微生物有一定影響，但是受土壤類型和植株生長時期的影響更大，這可能是因為不同玉米株系間自然變異所致，筆者研究結(jié)果與之相似。

筆者研究發(fā)現(xiàn)奇古菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門是細菌群落的優(yōu)勢種群，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對土壤細菌放線菌門有顯著影響(圖2)。放線菌廣泛存在于土壤中，對土壤有機物礦化有著重要作用[30]。筆者研究中GM處理土壤樣品總有機碳(TOC)含量在2個時期均高于CK處理，其中在S1時期達到顯著水平(t檢驗，P<0.05)，環(huán)境因子的微小變化可能對土壤微生物有顯著影響，這可能是GM處理放線菌門相對豐度顯著高于CK處理的原因(圖2)。對細菌同時期不同處理屬水平上物種進行分析，GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對豐度在2個時期分別比CK處理顯著低0.98%和6.02%，GM處理Marmoricola相對豐度在2個時期分別比CK處理高1.46%和1.03%(表3)，這可能是造成放線菌門產(chǎn)生品種差異的主要物種。土壤可溶性有機碳(DOC)可直接被土壤微生物利用，筆者研究中S2時期根際土壤DOC含量顯著高于S1時期，這可能是S2時期2個處理放線菌門相對豐度顯著高于S1時期的主要原因。BARRIUSO等[28]連續(xù)4 a種植轉(zhuǎn)Bt基因玉米，發(fā)現(xiàn)根際土壤細菌中優(yōu)勢種群主要是變形菌門、酸桿菌門和放線菌門，筆者研究與之有所不同。奇古菌門主要組成部分是氨氧化古菌，與土壤硝化作用密切相關(guān)[31]。筆者研究中各處理奇古菌門相對豐度較高，可能是由于在玉米生長過程中多次施肥導致，S2時期根際土壤全氮含量顯著高于S1時期(P<0.01)，這可能是S2時期2個處理奇古菌門相對豐度顯著高于S1時期的主要原因。對細菌同一處理不同時期屬水平上差異物種變化進行分析，S2時期Candidatus_Nitrocosmicus和Candidatus_Nitrososphaera相對豐度分別比S1時期顯著增加20.76%～23.33%和1.05%～6.09%(表3)，S2時期根際土壤細菌Chao1指數(shù)(P<0.05)和Shannon指數(shù)(P<0.01)均顯著低于S1時期，說明大量施加氮肥會增加物種豐度，降低物種多樣性，筆者研究結(jié)果與之相符。

3.3 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對根際土壤真菌群落的影響

真菌是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分，具有較高的生物活性[32]。根際真菌群落的組成和功能具有很強的動態(tài)性，受植物生長階段、土壤類型、年際和品種類型的影響較小[33]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤真菌群落豐度、多樣性和門水平上群落組成。LEE等[34]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻根際真菌群落豐度和多樣性與親本水稻間無顯著差異，筆者研究結(jié)果與之相似。王敏等[35]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤真菌數(shù)量，Bt玉米對根際細菌群落的影響大于真菌群落，筆者研究結(jié)果與之相似。LI等[36]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因棉花未顯著影響根際土壤真菌群落豐度和多樣性，真菌群落多樣性顯著受生長時期的影響，根系微環(huán)境會顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)。目前大多數(shù)關(guān)于土壤真菌群落的研究表明，轉(zhuǎn)基因作物對土壤真菌的影響與其親本相似。通過對真菌屬水平上差異物種變化進行研究發(fā)現(xiàn)，僅Fusarium、Staphylotrichum和Lophiostoma屬有顯著差異。相較于細菌，各處理真菌屬水平物種變化量較小，此與前人研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

近年來，由于轉(zhuǎn)基因作物在世界范圍內(nèi)的釋放以及對傳統(tǒng)作物的替代，轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境和人類健康的潛在風險一直備受關(guān)注，許多風險評估都集中于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤真菌群落，對細菌群落有一定程度的影響，但是受植株生長時期的影響更顯著。目前，轉(zhuǎn)基因作物使用的基因種類繁多，尚無通用的風險評估標準，研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響還需要長期連續(xù)監(jiān)測，確定外源基因?qū)胨鶐淼挠绊?，為轉(zhuǎn)基因作物推廣提供實驗數(shù)據(jù)。