棘胸蛙白內(nèi)障病癥的致病菌鑒定及其敏感藥物篩選

楊瀅 張雪萍 吳銳瓊 黃其鍛 李達(dá)諒 陸永樹(shù) 耿寶榮 陳友鈴 黃鎮(zhèn)

摘 要：棘胸蛙Quasipaa spinosa是福建省特色有藥用和食用價(jià)值的蛙類(lèi)品種，目前棘胸蛙的養(yǎng)殖已經(jīng)逐步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?，但是養(yǎng)殖中的疾病問(wèn)題隨著養(yǎng)殖密度的增加逐年加重。白內(nèi)障病癥是常見(jiàn)的棘胸蛙細(xì)菌性疾病之一，為解析棘胸蛙白內(nèi)障的致病菌以及對(duì)該病的防治，對(duì)患白內(nèi)障病棘胸蛙的器官進(jìn)行病原菌的分離純化并進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行了人工感染確定其致病性，最后通過(guò)抑菌圈法檢測(cè)該菌株對(duì)20種抗生素的敏感性。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，從患白內(nèi)障病的棘胸蛙內(nèi)臟中分離的細(xì)菌進(jìn)行人工感染后，可導(dǎo)致正常蛙出現(xiàn)白內(nèi)障病的病征，通過(guò)16S rDNA序列鑒定為彭氏變形桿菌Proteus penneri。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)氯霉素、多粘菌素B、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、米諾環(huán)素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林敏感，而對(duì)其他多種藥物耐受。本研究表明彭氏變形桿菌可導(dǎo)致棘胸蛙出現(xiàn)白內(nèi)障的病征，為棘胸蛙養(yǎng)殖過(guò)程中白內(nèi)障病的診斷及防治提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：棘胸蛙;白內(nèi)障病;致病菌;彭氏變形桿菌;藥敏試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S947.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2020）12-0009-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.002

Identification of Pathogenic Bacteria of Cataract in Quasipaa Spinosaand the Screening of Its Sensitive Drugs

YANG Ying1， ZHANG Xueping1， WU Ruiqiong1， HUANG Qiduan2，3， LI Daliang4，LU Yongshu5， GENG Baorong1， CHEN Youling1， HUANG zhen1*

（1. Fujian Key Laboratory of Developmental and Neural Biology/College of Life Science， Fujian Normal University，

Fuzhou， Fujian350117， China; 2. Fujian Jianfeng Biotechnology Co. Ltd， Quanzhou， Fujian 362500， China;

3. Fujian Shidongwang Biotechnology Research and Development Center Co. Ltd， Quanzhou， Fujian362500， China

4. Southern Center for Biomedical Research， Fujian Normal University，F(xiàn)uzhou， Fujian350117， China;

5. Tianfuying Agricultural Professional Cooperative， Nanping Fujian353602， China）

Abstract： Quasipaa spinosa is a typical breed of frog with medicinal and edible value in Fujian Province. At present， the breeding of Quasipaa spinosa has been gradually realized on a large scale， but the problems of diseases in the breeding process are increasing year by year with the increase of breeding density. Cataract is one of the common bacterial diseases of Quasipaa spinosa. In order to analyze the pathogenic bacteria of cataract and to prevent and treat the disease， the pathogenic bacteria were isolated， purified and identified from the organs of Quasipaa spinosa infected with cataract， and then the pathogenicity was determined by artificial infection. Finally， the sensitivity of this strain to 20 kinds of antibiotics was tested by using the inhibition zone method. The results of the artificial infection test showed that after the artificial infection， the bacteria isolated from Quasipaa spinosa infected with cataract could cause the symptoms of cataract in the normal frogs， and the pathogenic bacteria was identified as Proteus penneri by the 16S rDNA sequence analysis. The results of drug sensitive test showed that the strain was sensitive to chlorampenicol， Polymyxin B， ciprofloxacin， ofloxacin， norfloxacin， minocycline， neomycin， kanamycin， gentamicin， amikacin， cefoperazone， ceftriaxone， ceftazidime， cefuroxime， piperacillin， carbenicillin and ampicillin， while was resistant to many other drugs. This study indicated that Proteus penneri could cause the symptoms of cataract in Quasipaa spinosa， which would provide a theoretical basis for the diagnosis and prevention of cataract in the breeding process of Quasipaa spinosa.

Key words： Quasipaa spinosa; Cataract; Pathogenic bacteria; Proteus penneri; Drug sensitive test

棘胸蛙Quasipaa spinosa俗稱(chēng)石蛙、石雞等，隸屬于兩棲綱無(wú)尾目蛙屬，是我國(guó)特有的珍貴物種，在我國(guó)主要分布在福建、浙江、江西和湖南一帶。由于棘胸蛙肉質(zhì)鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，廣受人們的喜愛(ài)，同時(shí)它在中醫(yī)藥學(xué)方面具有較高的藥用價(jià)值，是近幾年來(lái)福建和浙江地區(qū)蛙類(lèi)養(yǎng)殖的主要品種之一。2020年以來(lái)，受新冠疫情影響，棘胸蛙一度被劃為野生動(dòng)物禁養(yǎng)，2020年5月28日《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家林業(yè)和草原局關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范蛙類(lèi)保護(hù)管理的通知》頒布，文件中明確了養(yǎng)殖歷史悠久、技術(shù)成熟的黑斑蛙、棘胸蛙、棘腹蛙、中國(guó)林蛙、黑龍江林蛙等品種按水生動(dòng)物管理，可以進(jìn)行人工飼養(yǎng)和食用，為整個(gè)棘胸蛙養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展明確方向。目前棘胸蛙的人工養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，但是隨著其養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過(guò)程中常爆發(fā)細(xì)菌性的感染疾病，成為棘胸蛙養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展中面臨的重大難題，因此解析棘胸蛙的病原菌對(duì)于疾病的治療和預(yù)防有重要的意義。

爛皮病、歪頭病、出血病及白內(nèi)障是棘胸蛙養(yǎng)殖過(guò)程中較為常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病。呂耀平等[1]從患爛皮病的棘胸蛙中分離出蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus，并發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌對(duì)棘胸蛙的肝、肺、舌和肌肉都造成了嚴(yán)重的損傷;王瑞君等[2]發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌Proteus vulgaris可使健康的棘胸蛙患爛皮病;宋婷婷等[3]從患病的棘胸蛙中分離出嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila經(jīng)人工感染后發(fā)現(xiàn)該菌可使棘胸蛙的肝臟發(fā)生病變甚至可導(dǎo)致棘胸蛙發(fā)病死亡;李明等[4]從患有歪頭病的棘胸蛙中分離出腦膜炎敗血金黃桿菌Chryseobacterium meningosepticum，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)注射該菌液或浸泡該菌液均可使棘胸蛙患病死亡;鄭衛(wèi)軍等[5]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii可引起棘胸蛙患出血病并使其發(fā)病死亡;程曉云等[6]研究發(fā)現(xiàn)布氏檸檬酸桿菌Citrobacter braakii可引起棘胸蛙發(fā)生白內(nèi)障的病癥。

白內(nèi)障病是棘胸蛙常見(jiàn)的細(xì)菌性疫病之一，表現(xiàn)為病蛙眼瞼灰白，食欲減退，易死亡，并且有很強(qiáng)的傳染性，給棘胸蛙的生產(chǎn)養(yǎng)殖造成極大的損失[6]。同時(shí)白內(nèi)障病的病原菌存在多樣性，不同的養(yǎng)殖環(huán)境下有不同的致病菌。本研究對(duì)福建省棘胸蛙養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)的患白內(nèi)障病棘胸蛙進(jìn)行采樣，從病蛙的心、肝、脾、肌肉組織中分離到了1株病原菌，鑒定其為彭氏變形桿菌P.penneri，并通過(guò)人工感染試驗(yàn)確定該病原菌對(duì)棘胸蛙的致病性，最后對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為患病棘胸蛙的治療以及日常疾病的監(jiān)測(cè)提供理論指導(dǎo)，降低棘胸蛙白內(nèi)障的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患白內(nèi)障病和健康的棘胸蛙均來(lái)自永定縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，病蛙平均體重為163 g，健康蛙平均體重為170 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 患病棘胸蛙剖檢和組織病理學(xué)觀察 取患病棘胸蛙的心、肝、脾、肌肉組織，用4%的PFA（多聚甲醛）溶液于4℃下將組織固定24 h。固定完成后，將樣品放在30%、50%、70%的酒精中進(jìn)行梯度脫水，之后試驗(yàn)樣品可放在70%的酒精中保存于-20℃冰箱。開(kāi)展包埋切片試驗(yàn)前，將樣品從90%、100%酒精中進(jìn)行梯度脫水，充分脫水后的組織經(jīng)二甲苯透明和石蠟包埋，制備成為蠟塊，之后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為8 μm。經(jīng)過(guò)伊紅蘇木精染色，中性樹(shù)脂膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)特征并拍照。

1.2.2 患病棘胸蛙中病原菌的分離與純化 對(duì)患病的棘胸蛙進(jìn)行解剖，取心、肝、脾、肌肉組織將其研磨，取少許研磨液涂布于固體腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行純化并培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 人工感染試驗(yàn) 將分離到的細(xì)菌液體腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，28℃下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，用0.45%的生理鹽水對(duì)菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)∠♂尯蟮木? mL涂布于健康棘胸蛙的體表進(jìn)行感染，同時(shí)設(shè)置無(wú)菌生理鹽水對(duì)照組，每組健康棘胸蛙數(shù)量為5只，每天觀察健康棘胸蛙的生命體征，觀察白內(nèi)障病征的出現(xiàn)。

1.2.4 病原菌的16S rDNA基因測(cè)序鑒定 對(duì)導(dǎo)致健康棘胸蛙出現(xiàn)白內(nèi)障病征的病原菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，取1 mL菌液提取DNA，采用16S rDNA基因的通用引物[7]擴(kuò)增基因片段，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5 分離菌藥敏試驗(yàn) 根據(jù)KB紙片擴(kuò)散法[8]，將分離到的致病菌置于腦心浸液液體培養(yǎng)基中，在28℃下震蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度，涂布于固體培養(yǎng)基中，將藥敏紙片放入其中，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 患白內(nèi)障棘胸蛙組織剖檢觀察

在外觀上，患病的棘胸蛙與正常的棘胸蛙相比，其腹部膨脹（圖1A），四肢腫大（圖1B），眼部異常，其眼角膜呈現(xiàn)乳白色，有“白內(nèi)障”的特征（圖1C）。解剖后發(fā)現(xiàn)病蛙腹腔內(nèi)部存在大量的積水（圖1D）。對(duì)病蛙的各個(gè)臟器進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)脾臟腫大且呈現(xiàn)黑紫色（圖1E）;肝臟膨大并出現(xiàn)一定量的花斑;心臟與正常的棘胸蛙對(duì)比也出現(xiàn)腫大（圖1F）。

2.2 患白內(nèi)障病棘胸蛙主要臟器的病理學(xué)觀察

對(duì)患病棘胸蛙的肌肉、肝臟、脾臟和心臟組織進(jìn)行石蠟包埋切片和伊紅蘇木精（H&E）染色，結(jié)果如圖2患病蛙的骨骼肌纖維嚴(yán)重變形，部分橫紋消失，部分細(xì)胞發(fā)生溶解，呈條狀或圓團(tuán)狀（圖2A）。肝組織壞死嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列松散，腫脹，無(wú)具體的細(xì)胞形態(tài)，甚至部分發(fā)生溶解（圖2B）。脾臟出現(xiàn)淤血現(xiàn)象，胞間隙增大，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（圖2C）。心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞溶解或壞死，細(xì)胞間的空泡變性，部分肌間隙出現(xiàn)淤血（圖2D）。

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（責(zé)任編輯：陳文靜）