一種茶樹促生菌固化劑的研制及其施用效果

羅 毅，張永利，夏先江，孫宇龍，蘇有健，廖萬有，王燁軍

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，安徽 黃山 245000）

茶樹［Camellia sinensis（L.）O.Kuntze］是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物。在我國，茶樹的種植面積超過266.7萬hm2，干毛茶產(chǎn)值超過1 519億元［1］。因此保持茶業(yè)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，對我國農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)發(fā)展有重要意義。然而由于茶樹為多年生木本植物，其生理特性和耕作管理措施有別于其它作物，因此土壤理化性狀在植茶后會發(fā)生顯著的變化，例如土壤pH值顯著降低，鈣、鎂等鹽基離子不斷減少，鋁、鐵、錳等元素相對累積，土壤微生物區(qū)系受到破壞，土壤供肥能力下降。另一方面，有“喜銨”肥特性的茶樹，每年的葉片采摘又會帶走大量的含氮營養(yǎng)物質(zhì)，使得土壤氮素供給的壓力逐步增大［2］。有機肥料由于其養(yǎng)分種類全面，從而在改良土壤結(jié)構(gòu)和改善作物品質(zhì)方面具有化學(xué)肥料不可比擬的作用。但有機肥養(yǎng)分含量低，短期內(nèi)有效養(yǎng)分少，難以滿足當季作物生長的需求［3］，因此，茶農(nóng)為提高產(chǎn)量，每年向茶園中施入大量的化學(xué)肥料，從而進一步加劇了土壤的酸化和養(yǎng)分失衡。在此背景下，利用植物根際促生菌Plant-Growth-Promoting Rhizobacteria（PGPR）生產(chǎn)微生物有機肥的研究逐漸成為熱點，前期報道較多的是利用芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）制備的微生物有機肥，其相關(guān)產(chǎn)品已在多種作物上起到良好的生物學(xué)效果［4-6］。這主要歸功于促生微生物在植物根際的定殖和生長為植物提供了養(yǎng)分和促生物質(zhì)。然而現(xiàn)有的微生物肥料多是針對中性土壤環(huán)境下篩選和應(yīng)用，肥料中的促生菌對酸性土壤中鋁毒害的耐受性很低。當土壤中的Al3+含量達到100 μ mol/L時就會引起細胞中毒［7］，而茶園土壤的活性鋁含量普遍超過 1 mmol/L（27 mg/kg）［8］，微生物細胞在酸性土壤中定殖和促生能力有限。因此，有必要篩選和利用適用于茶園土壤的具有耐酸鋁特性的促生菌株來研發(fā)生物肥料或其他形式的制劑。

此外，微生物產(chǎn)品在田間施用過程中，容易與土著菌產(chǎn)生惡性競爭，或者難以適應(yīng)溫度、水分、通氣和pH值等環(huán)境因子的劇烈變化，或因降水或灌溉造成流失，導(dǎo)致原本的高效菌株在土壤中的種群密度下降，難以發(fā)揮生物功能［9］。細胞固定化技術(shù)是通過物理或化學(xué)手段將游離的微生物或酶，定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性［10］。與其他應(yīng)用游離微生物的過程相比，固定化微生物技術(shù)可以使微生物在某一固定區(qū)域具有較高的密度，從而改變微環(huán)境，減輕或消除微生物的損失，提高微生物的使用效果［11-12］。例如姜天翔等［13］利用聚乙烯醇、1%的海藻酸鈉和活性炭作為包埋劑包埋石油降解菌在含油海水中使用，對石油的降解率較游離菌提高了22.6%。Bramhachari等［14］利用鄰苯二酚為唯一炭源，篩選到一株氧化木糖無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans 15DKVB），游離菌體降解500 mg/L鄰苯二酚污染物需60 h，而利用海藻酸鈉包埋后42 h可去除相同濃度的鄰苯二酚，目前已被用于造紙廠污水和污染土壤處理方面。但是，目前利用該技術(shù)在茶園土壤上開展養(yǎng)分活化方面的相關(guān)報道尚少。

本試驗以篩選得到的適應(yīng)茶園酸性土壤環(huán)境的促生微生物為材料，通過活性炭、海藻酸鈉和瓊脂的吸附和包埋作用制備固化菌球，結(jié)合茶園有機肥施用措施，比較和評價功能菌在土壤中的定殖狀況及其對茶園土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的作用，為改善茶園土壤養(yǎng)分狀況和肥料的高效利用提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和培養(yǎng)基

本研究篩菌所用的土壤為黃山、霍山、武夷山、東至和南京等地的茶園土壤。所用培養(yǎng)基有：S-LB培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.2 g，NaCl 10 g，用土壤浸提液定容至1 L，固體加入2.5%的瓊脂，加AlCl3至不同的濃度；GM培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，NaCl 5 g，酵母提取物0.2 g，蛋白胨0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，固體加入2.5%的瓊脂，蒸餾水1 L；阿須貝無氮菌培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，甘露醇 10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂粉18～20 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。

1.2 耐酸鋁促生菌的篩選和鑒定

稱取5 g土壤放入45 mL的S-LB液體培養(yǎng)基（鋁離子濃度50 mmol/L）30℃培養(yǎng)過夜，靜置后取上清液100 μL，涂布于含相同鋁離子濃度的S-LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，將長出的菌落，劃線到鋁濃度100 mmol/L（pH=3.0）的S-LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)。將分離純化的菌株，點接于阿須貝無氮培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)，挑選菌落較大的菌株。將初篩獲得的耐酸鋁促生菌，活化后用Salkowski比色法［15］對其生長素分泌能力進行檢測。挑選生長素分泌較高的菌株接入含10 mL蛋白胨的無菌水（10 g/L）試管中，28℃培養(yǎng)3 d后，每管加入0.5 mL Nessler’s試劑，測定其有無有機質(zhì)礦化后的產(chǎn)氨能力，出現(xiàn)紅褐色沉淀視為礦化產(chǎn)氨的陽性反應(yīng)［16］。菌株鑒定采用分子生物學(xué)方法進行，菌株送生物（上海）公司測序鑒定。使用BLAST將測序結(jié)果在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上比對，根據(jù)同源性搜索結(jié)果，使用MEGA 5.0生物學(xué)軟件對測試菌株和相關(guān)菌株的多個序列進行比對分析及Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 固定化菌劑的制備

以終體積的0.25%添加活性炭到步驟1.2篩選出的菌株生長對數(shù)期的培養(yǎng)液中，10～12℃，轉(zhuǎn)速130 r/min過夜，分別稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉、瓊脂和30%甘油，煮沸溶解，配成一定含量的混合溶液，冷卻至40℃左右加入一定量的活性炭吸附的菌懸液包埋，攪拌均勻后用注射器滴入4%的CaCl2溶液與飽和硼酸溶液組成（用NaCO3調(diào)節(jié)pH值至6.7）的交聯(lián)劑中進行交聯(lián)，完成后用蒸餾水沖洗2～3次，保存于生理鹽水（0.9%）中待用。對其溶脹性、完整性和菌體生長傳質(zhì)性進行測定，依此優(yōu)化包埋劑和包菌量。溶脹性測定：取一定數(shù)目的固定化菌劑放入燒杯中，加入蒸餾水后進行持續(xù)曝氣，觀察小球溶脹、破損情況。完整性：取一定數(shù)目的固定化菌劑放入燒杯中，加入蒸餾水后利用攪拌器進行攪拌（200 r/min），查看攪拌后剩余結(jié)構(gòu)完整的小球數(shù)量。傳質(zhì)性：取一定數(shù)量固定化菌劑投入盛有200 mL GM液體培養(yǎng)基（含10 mmol/L鋁離子）中培養(yǎng)，48 h后測定培養(yǎng)液中OD600值。

1.4 田間試驗設(shè)計

田間試驗于2018年6月布置于安徽省黃山市屯溪示范茶場，地處118.27°E，29.69°N，海拔143.4 m，年平均降水量1 670 mm，年平均氣溫15.8℃，屬北亞熱帶濕潤性季風氣候。試驗茶園0～20 cm土層土壤的基本理化性質(zhì)為：pH值4.68，有機質(zhì)15.6 g/kg，總氮1.05 g/kg，堿解氮86.50 mg/kg，有效磷（Olsen-P）32.76 mg/kg，速效鉀47.97 mg/kg，銨態(tài)氮43.8 mg/kg。茶樹品種為當?shù)厝后w種。試驗共設(shè)置4個處理：分別為CK（空白對照）、T1（2 250 kg/hm2商品有機肥+WYS2菌懸液，108cfu/g有機肥）、T2（2 250 kg/hm2商品有機肥+WYS2固定化菌劑，108cfu/g有機肥）、OM（2 250 kg/hm2商品有機肥對照）。試驗開始于2018年6月上旬，距茶樹行20 cm處開溝施肥，開溝深度為15～20 cm，2018年7月中旬取樣。采用完全區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，小區(qū)面積3 m×5 m=15 m2。整個試驗于2018年8～10月重復(fù)一次，試驗結(jié)果相似。

1.5 土樣采集和指標測定方法

土壤取樣時間為試驗處理40 d后，采集0～20 cm土壤樣品，每個小區(qū)隨機取5點，同小區(qū)混合后過2 mm篩，平均分成兩份，一份新鮮保存以測微生物性狀，一份風干后測土壤養(yǎng)分性狀。土壤微生物區(qū)系采用高通量測序法，測序采用Miseq（Illumina，美國）高通量平臺，選用的引物針對真菌ITS1-2區(qū)。前引物序列為5’-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3’，后引物序列為5’-GCTGC GTTCTTCATCGATGC-3’［17］測序后的DNA序列拼接，同時對序列的質(zhì)量和拼接效果進行質(zhì)控過濾，然后按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到有效數(shù)據(jù)。采用Usearch軟件（vsesion 7.1 http：//qiime.org/），設(shè)置97%相似性，對有效DNA序列數(shù)據(jù)進行操作分類單元（OTU）統(tǒng)計和分類［18］。測定土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化容量法-外加熱法；測定全氮含量采用半微量凱式定氮法；測定堿解氮含量采用堿解擴散法；測定有效磷含量采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法（Olsen-P）；測定速效鉀含量用乙酸銨浸提-火焰光度法；測定銨態(tài)氮含量用氯化鉀提取-靛酚藍比色法［19］。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進行統(tǒng)計和方差分析，用LSD法比較處理間的差異顯著性，用Origin 8作圖。Miseq測序后的物種分類是利用blastn將OTU序列與對ITS真菌核糖體數(shù)據(jù)庫（http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進行過濾，滿足相似度＞90%且coverage＞90%的序列被用來分類，不滿足條件的序列則被歸為unclassified，樣本聚類樹圖是根據(jù)物種多樣性距離矩陣進行層次聚類（Hierarchical cluatering）分析，再使用非加權(quán)組平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法構(gòu)建，反映出樣品間的相似性和差異，以上分析均利用R軟件（version2.15.1，http：//www.r-project.org/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸鋁促生菌的篩選與鑒定分析

用S-LB培養(yǎng)基逐級提高鋁離子濃度降低pH值，分別從5個地區(qū)的茶園土壤中純化、篩選到4株耐酸鋁能力較強的菌株。由于茶樹對氮素的需求較大，占干物質(zhì)重的3.5%～5.8%［20］。因此對這4株菌進行促生特性復(fù)篩時以無氮生長和對有機質(zhì)礦化的產(chǎn)氨特性為主要參考。其相關(guān)促生指標如表1所示，其中菌株WYS2可在無氮培養(yǎng)基中生長，同時具有產(chǎn)氨和較強生長素分泌能力，因此選擇該菌為材料進行下一步試驗。

表1 4株耐酸鋁菌株的促生特性

菌株WYS2在S-LB平板表面生長的菌落呈圓形、紅色，表面光滑、邊緣整齊（圖1），通過分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，其26S rRNA D1/D2序列與紅酵母菌（Rhodotorula spp.）26S D1/D2區(qū)核糖體序列相似度達100%，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。因此將菌株WYS2命名為Rhodotorula sp.WYS2，將其序列保存于美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GeneBank中，登錄號為KY670833。

2.2 固化菌劑特性研究

由表2可知，4%海藻酸鈉（SA）+1%瓊脂（AG）+2%包菌量制備的1#固定化小球的溶脹率最低、完整性最高，表明其機械強度最高，但生長傳質(zhì)性能較差，培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液中的菌體濃度較低；同樣包埋劑濃度條件下增加包埋菌量的2#固定化小球其生長傳質(zhì)性能也較差，表明包埋劑濃度影響菌株從球體到外部的穿通性。降低SA并升高AG濃度后發(fā)現(xiàn)，球體的生長傳質(zhì)性能提高，但包菌量較大處理（4#）的球體穩(wěn)定性較差，在水中曝氣一定時間后容易發(fā)生溶脹現(xiàn)象。而使用1%SA+2%AG包埋2%菌體制作的小球（3#），在水中曝氣時的溶脹率變化較低，200 r/min攪拌4 h過程中所有小球表面保持光滑完整，溶液保持澄清，同時其生長傳質(zhì)性能也較好。因此選擇3#小球作為下一步試驗的材料，其外表形狀如圖3所示。

圖1 菌株WYS2形態(tài)特征

圖2基于26S序列構(gòu)建的菌株WYS2系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 不同包埋劑量制備出的固定化小球性能測試

圖3 固定化菌劑

2.3 促生菌的土壤定殖效果

對土壤真菌宏基因組高通量測序以探究施用固化菌劑后菌株Rhodotorula sp.WYS2在茶園土壤中的定殖效果和對土壤真菌的影響。從土壤定殖效果來看，有機肥+固化菌劑處理（T2）的土壤中Rhodotorula（紅酵母菌）基因序列數(shù)量約為有機肥+菌懸液處理（T1）的293倍（表3），表明T2處理在較長的時間內(nèi)可以保持紅酵母菌的種群密度。從真菌的區(qū)系組成（圖4）來看，在T2處理的土壤中紅酵母菌基因豐度比例占土壤真菌總和的35.33%，是最為主要的真菌類群；而T1處理的紅酵母菌基因豐度僅占真菌總量的0.12%；純有機肥處理（OM）和空白對照（CK）中均沒有檢測到紅酵母基因序列。其結(jié)果表明固定化技術(shù)使用后菌株WYS2在茶園土壤中具有良好的定殖效果，同時也增加了土壤青霉菌（Penicillium，占30.41%）、踝節(jié)菌（Talaromyces，占13.87%）和裸傘菌（Gymnopilus，11.04%）等在土壤真菌中的豐度比，而其它各處理及對照的真菌區(qū)系主要是由未分類的真菌屬組成。從區(qū)系組成的相似度聚類結(jié)果來看，T1處理和純施有機肥處理（OM）的真菌群落組成極為相似，同時與對照組真菌群落組成也較為相似，這可能由于直接將菌懸液與有機肥接種后WYS2在土壤中的定殖效果不佳，未對土壤原著菌群造成影響有關(guān)；另一方面，T2處理的真菌群落結(jié)構(gòu)與其他處理間存在較大差異。

表3 各樣本主要菌種屬水平上序列數(shù)（前5） （條數(shù)/g土）

圖4 土壤真菌區(qū)系及聚類圖

2.4 施用固定化菌劑對茶園土壤養(yǎng)分性狀的影響

如表4所示，有機肥+固定化菌劑處理（T2）、有機肥+菌懸液處理（T1）和有機肥施用處理（OM）與空白對照（CK）相比，土壤養(yǎng)分均有顯著增加，但施用有機肥的3個處理之間的土壤有機質(zhì)、全氮含量無顯著差異。此外，T2處理顯著提升了茶園土壤的堿解氮、速效鉀和銨態(tài)氮含量，其堿解氮含量與T1相比增加了23.4%，與OM處理相比增加了39.8%；其速效鉀含量較T1和OM處理分別提高了25.1%和18.1%；對于茶樹最易吸收利用的氮素形態(tài)（銨態(tài)氮）含量，T2處理較T1處理增加了36.4%，較OM處理增加了45.1%，而有效磷的含量T2與T1處理無顯著差異。因此從茶樹的需肥規(guī)律和施肥效果來看，含紅酵母菌WYS2的固定化菌劑+有機肥的處理有助于茶園土壤肥力的提升。在該處理中紅酵母菌WYS2基因在土壤中有較高的豐度比，土壤中有效態(tài)氮、磷和鉀的養(yǎng)分含量最高，其中堿解氮、銨態(tài)氮和速效鉀含量均顯著高于其它處理，而有機肥接種紅酵母菌WYS2菌懸液的處理，紅酵母菌WYS2基因在土壤中的豐度比較低，同時除土壤有效磷外，氮和鉀的有效態(tài)養(yǎng)分含量與純有機肥處理無顯著差異。

表4 施用固定化菌劑對土壤養(yǎng)分的影響

3 討論

本研究篩選獲取了紅酵母菌屬的一株酵母菌，其具有良好的耐酸鋁特性，是酸性土壤中常見的土壤真菌，也是對植物生長有促生作用的一類菌群［21-22］。紅酵母屬在生長過程中能合成大量的不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和生長因子等高附加值和營養(yǎng)價值的代謝產(chǎn)物，因此已被工業(yè)化培養(yǎng)用于油脂生產(chǎn)［23］、保健品生產(chǎn)［24］和水產(chǎn)養(yǎng)殖［25］等領(lǐng)域，而對紅酵母屬真菌在茶園土壤中的定殖利用和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化作用方面的研究報道尚少。植物促生功能菌結(jié)合有機肥的施用在一定程度上具有促進有機肥中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化效率、增加產(chǎn)量、提升品質(zhì)和保護環(huán)境等優(yōu)勢和特點，被認為是提高肥料利用效率、減少化肥施用的有效措施之一［6］。但由于功能菌群需在土壤中定殖、繁殖后方可發(fā)揮效用，而菌群的生長又具有周期性，肥效見效過程較長，同時，微生物活性受很多因素影響，導(dǎo)致施用后的短時期內(nèi)（25 d）功能菌數(shù)量就急劇減少，效果不穩(wěn)定［4，26］，這與本研究中利用游離菌劑結(jié)合有機肥施用的結(jié)果相類似，本研究中40 d后紅酵母菌WYS2在土壤中定殖數(shù)量較低，基因豐度僅占土壤真菌比例的0.12%。而固定化后配合有機肥施用的結(jié)果表明，在施用40 d后可顯著提高紅酵母菌WYS2在土壤中的定殖效果，同時可改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

氮素和鉀素是茶樹生長發(fā)育不可或缺且需求量最大的兩類礦質(zhì)元素，在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶園中，土壤堿解氮和速效鉀均應(yīng)≥100 mg/kg，同時研究表明茶樹吸收利用銨態(tài)氮能力較強，而對硝態(tài)氮的利用能力較差［27］。吳志丹等［28］認為純有機肥施用會提升土壤堿解氮和速效鉀含量，但會降低土壤銨態(tài)氮含量，而配合50%～75%化肥（以氮素投入量計）可顯著提高土壤銨態(tài)氮含量9.5～11.3倍。本試驗中施用紅酵母菌WYS2固定化菌劑后對土壤堿解氮含量的提升作用高于前者的試驗結(jié)果，對銨態(tài)氮含量的提升作用低于前者的試驗結(jié)果，這種差異可能是兩地土壤性狀和有機肥種類等因素造成，例如，其有機肥處理中土壤銨態(tài)氮含量僅為7.61 mg/kg，而本試驗有機肥處理土壤銨態(tài)氮含量為78.2 mg/kg。此外與任軼等［29］報道的木霉微生物肥相比，木霉對土壤有機質(zhì)礦化為銨態(tài)氮的過程無顯著作用，而本試驗中紅酵母菌WYS2固定化菌劑加有機肥處理可顯著提升土壤銨態(tài)氮含量，因此本試驗菌株更適合于茶樹生長的養(yǎng)分需求。本試驗有機肥接種紅酵母菌WYS2固定化菌劑后對土壤有效磷和速效鉀含量也有顯著提升，其對土壤速效鉀（與純有機肥處理相比）含量的提升率為18.1%，較付學(xué)琴等［30］報道的硅酸鹽細菌肥料對水稻土速效鉀41.5 %的提升率而言略低，這可能是與硅酸鹽細菌和紅酵母菌兩種微生物間不同的解鉀特性有關(guān)。

4 結(jié)論

紅酵母屬的菌株WYS2具有良好的耐酸鋁性和促生特性。

利用0.25%活性炭吸附2% WYS2菌體后，再用1%海藻酸鈉+2%瓊脂包埋制作的促生菌固化菌劑具有良好的機械強度和生長傳質(zhì)性。

制成的固定化菌劑配合有機肥施用，不僅提高了促生菌株在茶園土壤中的定殖效率，還可以影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而提高茶樹可利用的氮素和鉀素養(yǎng)分含量，改善土壤肥力狀況。