■車常寶 石 勇 胡 毅 鐘 蕾

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide），是從爵床科草本穿心蓮[Andrographis panicultata（Burm.f）]全草中提取的主要有效成分[1]，Zhou等[2]、Lee等[3]和Wong等[4]表明穿心蓮內(nèi)酯具有治療病毒感染、抗炎和抗癌作用。給每千克魚體投喂10～30 mg/d 黃芪多糖可增強(qiáng)草魚（Ctenopharyngodon idella）[5]非特異性免疫功能。在飼料中添加1 g/kg三丁酸甘油酯[6]、0.4%甘露寡糖[7]能分別促進(jìn)建鯉（Cyprinus carpiovar Jian）、鰻鱺（Anguilla anguilla）生長、增強(qiáng)腸道消化酶活性和提高魚體非特異性免疫力；適宜劑量的膽汁酸、?；撬崮芴岣咚a(chǎn)動(dòng)物氧化能力，調(diào)節(jié)牛蛙（Ranacatesbeiana）[8]肝臟脂類代謝水平，減輕鯉魚（Cyprinus carpio）[9]的脂質(zhì)過氧化作用。有關(guān)研究顯示，投喂由甘露聚糖、β-葡聚糖組成的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑相比單獨(dú)投喂能進(jìn)一步提高刺參（Apostichopus japonicus）[10]的生長率、非特異性免疫酶活性，且其持續(xù)時(shí)間更長；0.2%黃芪多糖、人參莖葉皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5 種配比的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑能夠提高鯉魚[11]增重率和降低飼料系數(shù)，促進(jìn)鯉魚的生長和提高魚體非特異性免疫。

黃鱔(Monopterus albus)，亦稱鱔魚，目前我國黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)30萬噸[12]，產(chǎn)值超過210億元。近年來我國養(yǎng)殖量不斷加大，使得疾病狀況日趨嚴(yán)重，同時(shí)抗生素的大量使用使得黃鱔抗病力下降，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的損失[13]。

本試驗(yàn)利用不同免疫增強(qiáng)劑之間的協(xié)同作用，通過合理的配比，有選擇性的將幾種免疫增強(qiáng)劑搭配使用，旨在研究以穿心蓮內(nèi)酯為主的黃鱔水產(chǎn)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑，替代抗生素，促進(jìn)魚類生長，增強(qiáng)魚體免疫力，提高魚類抗病、防病能力和抗逆性，以期為水產(chǎn)動(dòng)物免疫增強(qiáng)類添加劑替代抗生素的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

穿心蓮內(nèi)酯（純度98%，購于湖南佳瑞思生物科技有限公司）、三丁酸甘油酯（購于青島柯能生物科技有限公司）、膽汁酸（購于山東龍昌動(dòng)物科技有限公司）、甘露寡糖（購于青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司）、黃芪多糖（購于四川省環(huán)亞生物科技有限公司）、?；撬幔ㄙ徲谠慈~生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)飼料

以黃鱔商品飼料為基礎(chǔ)，配制出一種以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，魚油為脂肪源的基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。復(fù)配1（F1，基礎(chǔ)飼料+0.05%穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯0.05%+膽汁酸0.02%+甘露寡糖0.04%）、復(fù)配2（F2，基礎(chǔ)飼料+0.05%穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯0.05%+黃芪多糖0.05%+?；撬?.02%）。飼料原料經(jīng)先粉碎過60 目篩網(wǎng)，再按配比從小到大逐級(jí)定量均勻混合，再將其進(jìn)入V 型攪拌機(jī)充分混合25 min，隨后將魚油與已混好的干粉充分混勻，飼料風(fēng)干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，投喂前?0%水調(diào)成面團(tuán)狀使用。

1.3 飼養(yǎng)與管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在湖南省常德市西湖鎮(zhèn)黃鱔實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，通過池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖方式進(jìn)行試驗(yàn)，放入網(wǎng)箱后停食48 h，用蚯蚓和魚漿進(jìn)行前期馴化，馴養(yǎng)到能夠正常攝食全魚漿。后期馴化投喂飼料與魚漿混合物(比例1∶4)，根據(jù)攝食情況提高飼料的比例，直至黃鱔完全攝食飼料，整個(gè)馴化時(shí)間約為15 d，停食24 h后，挑選初始體重為(25.00±0.05) g 的黃鱔隨機(jī)分成3 組，每組3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)網(wǎng)箱(1.5 m×2.0 m×1.0 m)，每個(gè)網(wǎng)箱飼養(yǎng)60 尾黃鱔。日投喂1 次(17:00～18:00)，投喂量為黃鱔體重的3%～5%，每星期調(diào)整一次投喂量，養(yǎng)殖時(shí)間持續(xù)56 d。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖56 d后，禁食24 h，分別取出各網(wǎng)箱的黃鱔，稱量總重并記錄尾數(shù)，每個(gè)網(wǎng)箱采集5 尾魚，用2 ml注射器尾靜脈取血，將血液混合并置于無菌離心管中，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；取魚體肝臟保存于-80 ℃冰箱備用；分別取魚體肝臟、腸道組織于1.5 ml無RNA酶管中，封口膜封口后置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.5 指標(biāo)測定方法

1.5.1 生長指標(biāo)

試驗(yàn)起始和結(jié)束時(shí)分別對各網(wǎng)箱黃鱔進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重計(jì)算特定生長率、增重率、成活率和餌料系數(shù)。

特定生長率(SGR，%/d)=（lnW2-lnW1）×100/t

增重率(WGR，%)=(W2-W1)/W1×100

存活率(SR，%)=(N1-N2)/N1×100

餌料系數(shù)（FCR）=F/（W2-W1）

式中：W1——試驗(yàn)開始時(shí)黃鱔總重(g)；

W2——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)黃鱔總重(g)；

t——飼養(yǎng)天數(shù)(d)；

F——餌料攝入量(g)；

N1——試驗(yàn)魚初始尾數(shù)；

N2——試驗(yàn)魚結(jié)束尾數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)束后每網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾黃鱔，記錄體長和體重，解剖取內(nèi)臟并分離肝臟稱重，計(jì)算肝體比、臟體比和肥滿度。

肝體比（HSI，%）=肝臟重/體重×100

臟體比（VSI，%）=內(nèi)臟重/體重×100

肥滿度（CF，%）=體重（g）/[體長（mm）]3×100

1.5.2 體成分

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾黃鱔用于體成分檢測。其中水分含量的測定采用105 ℃烘箱干燥恒重法，粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量的測定采取索氏抽提法，粗灰分含量的測定采用550 ℃灼燒法。

1.5.3 酶活性指標(biāo)

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、葡萄糖（GLU）、總膽汁酸（TBA）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）以及腸道脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶按照從南京建成生物工程研究所訂購的試劑盒的要求進(jìn)行檢測；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)以及肝臟中谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（TAOC）按照從南京建成生物工程研究所訂購的試劑盒的要求進(jìn)行檢測；血清免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體4(C4)指標(biāo)按照從浙江伊利康生物技術(shù)有限公司訂購的試劑盒的要求進(jìn)行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS20.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（mean±SE）表示，先對數(shù)據(jù)做單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan's法多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔生長性能的影響(見表2)

表2 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔生長性能的影響

由表2可知，F(xiàn)1、F2組的餌料系數(shù)顯著低于F0組（P＜0.05），而增重率、特定生長率則與之相反；各組肝體比、臟體比、肥滿度均低于F0 組，但與F0 組相比無顯著差異（P＞0.05）；在復(fù)配組之間，F(xiàn)1組的增重率、特定生長率、肝體比、臟體比最高，F(xiàn)2 組次之，而存活率、肥滿度與之相反。

2.2 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔腸道消化酶活性的影響（見表3）

表3 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔腸道消化酶活性的影響

由表3 可知，F(xiàn)1、F2 組黃鱔腸道胰蛋白酶活性顯著高于F0 組，但F1、F2 組之間差異不顯著。與F0 組相比，F(xiàn)2組淀粉酶活性顯著高于F0組（P＜0.05），F(xiàn)1組與F0、F2組差異不顯著（P＞0.05）；F1組脂肪酶活性顯著高于F0 組（P＜0.05），但F2 組與F0 組無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔體成分的影響（見表4）

表4 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔體成分的影響(%)

由表4 可知，各組黃鱔粗灰分含量無顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組粗蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；F1組粗脂肪含量顯著低于F0組（P＜0.05），但F2組與F0組無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔血清免疫相關(guān)酶活性的影響（見表5）

表5 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔血清免疫相關(guān)酶活性的影響

由表5 可知，各組黃鱔血清中IgM 含量無顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組血清中SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；F1組血清中CAT活性顯著升高（P＜0.05），C4含量和AKP 活性顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)2 組與F0 組無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔肝臟抗氧化能力的影響（見表6）

由表6可知，各組黃鱔肝臟CAT含量無顯著影響（P＞0.05）。與F0組相比，F(xiàn)1組和F2組GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；F1 組肝臟SOD活性顯著升高（P＜0.05），T-AOC含量顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)2組與F0組無顯著差異（P＞0.05）。

表6 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔肝臟抗氧化能力的影響

2.6 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響（見表7）

表7 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，各組黃鱔血清AST活性、GLU、TBA、TC 含量無顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組ALT 活性、LDL 含量顯著降低（P＜0.05）；F1 組血清HDL含量顯著低于F0組（P＜0.05），F(xiàn)2組與F0組無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔生長性能的影響

本研究中，黃鱔基礎(chǔ)飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均能提高黃鱔增重率、特定生長率、腸道消化酶活性，降低餌料系數(shù)，提高黃鱔生長性能。這與翟秋玲等[14]在菊黃東方鲀基礎(chǔ)飼料中添加50 mg/kg 三丁酸甘油酯+250 mg/kg 甘露寡糖可維護(hù)菊黃東方鲀的腸道健康，增強(qiáng)腸道消化酶活力，提高飼料效率和生長性能；Bo Liu 等[15]研究表明甘露寡糖可以提高異育銀鯽的存活率、生長性能；牛志偉[16]通過Meta 分析法表明甘露寡糖具有提高魚類、南美白對蝦、海參的增重率和特定增長率，可以顯著降低魚類的餌料系數(shù)；杜宗君等[17]研究表明在飼料中添加200、400 mg/kg 甘露寡糖，可顯著提高泥鰍的特定生長率和肥滿度，降低了餌料系數(shù)，促進(jìn)泥鰍的生長研究相似。同時(shí)，在唐啟峰等[18]、Hou 等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯均能提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長性能。同時(shí)，本試驗(yàn)中F1、F2組粗脂肪均低于F0組，粗蛋白均高于F0 組，表明以上兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均能提高蛋白質(zhì)的利用以及促進(jìn)脂肪的消化吸收。由表2、表3、表4可知，在提高生長性能方面，F(xiàn)1組效果更好，這可能是由于F1 組免疫增強(qiáng)劑的協(xié)同效果更優(yōu)于F2 組，也有可能是前者添加的單一免疫增強(qiáng)劑配比更佳。

3.2 兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對黃鱔血清、肝臟生化及免疫功能的影響

AST是一種重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，活性的變化也是反映肝細(xì)胞受到損傷的主要敏感指標(biāo)。正常情況下，動(dòng)物的血清中只含有微量的AST，當(dāng)血清中AST的活性升高或組織內(nèi)AST的活性降低時(shí)，即表明動(dòng)物機(jī)體的肝臟、心臟等內(nèi)臟器官發(fā)生損傷[20]。ALT 廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，是機(jī)體內(nèi)中間代謝的重要反應(yīng)酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起主要作用，其活性也是反映肝細(xì)胞受損傷的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，F(xiàn)1、F2組AST 活力略低于F0組，而ALT活力則顯著低于F0組，且復(fù)配組之間AST、ALT 活力差異不顯著，以上表明添加的兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均可保護(hù)肝細(xì)胞不受損害，增強(qiáng)對機(jī)體的保護(hù)功能。血清TC可反映機(jī)體脂肪代謝的總體情況。本試驗(yàn)中，F(xiàn)I、F2組復(fù)合免疫增強(qiáng)劑較F0組有降低血清TC 含量的能力。有研究表明，一定劑量的果寡糖可降低異育銀鯽的血清膽固醇和甘油三脂的含量[21]；在飼料中添加果寡糖和甘露寡糖，降低了大菱鲆幼魚血清總膽固醇和甘油三酯含量[22]，以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果類似，同時(shí)，復(fù)配組黃鱔魚體粗脂肪含量、血清LDL含量均低于F0組，表明甘露寡糖可通過降低魚體血清TC、LDL 含量、魚體粗脂肪來調(diào)節(jié)脂類代謝，寡糖具有調(diào)節(jié)動(dòng)物血清中生化指標(biāo)和改善動(dòng)物健康狀況的功能。

AKP是魚類代謝過程中重要的調(diào)控酶，可以催化磷酸單酯的水解及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對機(jī)體非特異性免疫也發(fā)揮著重要作用，AKP活性的高低可以用來判斷魚類非特異性免疫機(jī)能的強(qiáng)弱[23]。免疫球蛋白因其具有結(jié)合抗原、激活補(bǔ)體和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等生物學(xué)功能，且能夠反映出機(jī)體的免疫水平，甚至能夠直觀地反映免疫組織器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的變化[24]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)2 組AKP 含量略低于F0 組，F(xiàn)1組顯著低于F0 組，這與徐磊等[25]研究表明連續(xù)投喂240、480 mg/kg甘露寡糖組能顯著提高異育銀鯽AKP活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，這可能是同種免疫增強(qiáng)劑添加對象、添加劑量或者復(fù)配形式不同，其使用效果也有一定差異。

SOD在抗氧化酶系統(tǒng)中起防御作用，可催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)；MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈終止階段產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，它的變化趨勢可以間接反映動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力強(qiáng)弱；T-AOC反映機(jī)體對外來刺激的抵抗能力及體內(nèi)自由基代謝狀態(tài)，它是反映動(dòng)物機(jī)體氧化應(yīng)激的典型指標(biāo)[26]。有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在外周組織中具有抗炎和抗氧化活性[27]，可降低CNS 中氧化應(yīng)激[28]，也可能通過上調(diào)Nrf2，一種抗氧化反應(yīng)的主調(diào)節(jié)因子，對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞具有抗氧化作用[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主不同配比的免疫增強(qiáng)劑均能提高黃鱔的血清非特異性免疫能力，表現(xiàn)為F1、F2組黃鱔血清SOD 活性均顯著高于F0 組以及MDA 含量顯著低于F0 組。Sani 等[30]研究表明穿心蓮內(nèi)酯下調(diào)促炎細(xì)胞因子和自由基產(chǎn)生，艾春漢等[31]研究表明將穿心蓮浸膏粉添加到羅非魚飼料中，可顯著降低其肝臟中MDA含量，并顯著提高其血清中SOD活力，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，這表明穿心蓮內(nèi)酯可增強(qiáng)黃鱔機(jī)體免疫力。F1 組黃鱔血清、肝臟SOD 活力、CAT含量均高于F0組，與于朝磊等[32]發(fā)現(xiàn)甘露寡糖可顯著提高半滑舌鰨稚魚的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力研究結(jié)果一致，這可能是甘露寡糖與動(dòng)物腸道的病原菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、梭狀芽抱桿菌等）特異性結(jié)合，減少其與動(dòng)物腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而起到競爭抑制的雙重營養(yǎng)免疫作用。黃芪多糖具有提高SOD的表達(dá)，降低MAD的含量的作用，具有很強(qiáng)抗氧化活力[33]，在尼羅羅非魚[34]、黃顙魚[35]的基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的黃芪多糖可以提高魚體超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性并有效地提高魚體的抗氧化能力，以上實(shí)驗(yàn)研究與本試驗(yàn)結(jié)果類似，這表明幾種免疫增強(qiáng)劑合理配比能夠明顯提高黃鱔機(jī)體抗氧化能力，有利于提高魚體抗病力。

另外，穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯+膽汁酸+甘露寡糖、穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯+黃芪多糖+?；撬釋ν段裹S鱔生長和抗氧化能力的影響表現(xiàn)出高度的一致性，因此，以上復(fù)合免疫增強(qiáng)劑投喂黃鱔對其抗氧化能力的提高，在一定程度上促進(jìn)了機(jī)體免疫機(jī)能的改變，繼而提高了黃鱔機(jī)體抗病力，可能是促進(jìn)其生長的一個(gè)重要原因，但各組分在提高黃鱔非特異性免疫力過程中的作用及交互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

免疫增強(qiáng)劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物生長性能，又能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力的優(yōu)點(diǎn)，可以作為預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病暴發(fā)的好產(chǎn)品。在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)黃鱔生長性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，其中F1 組效果更好，F(xiàn)2組次之，但各組分在提高黃鱔非特異性免疫力過程中的交互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。