5種豆類中總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性比較研究

劉仙俊，張慧珍，王瀟瀟，李合，李波

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西太原030021）

豆類中含有豐富的多酚類、黃酮類等生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)被稱為天然抗氧化劑，具有清除人體內(nèi)多余的自由基，保護(hù)機(jī)體免受活性氧自由基攻擊而導(dǎo)致的人體內(nèi)脂質(zhì)過氧化、酶失活、核酸和蛋白質(zhì)損傷等，能夠減緩衰老、增強(qiáng)人體免疫力，并防止人體內(nèi)發(fā)炎、癌變、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等疾病的產(chǎn)生[1-13]。

國內(nèi)外對豆類生物活性物質(zhì)的研究有很多報(bào)道，Singh等研究表明綠豆總多酚的總抗氧化活性、鐵還原力和DPPH自由基清除活性都比較好[14]。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)紅刀豆種皮中含有豐富的多酚類物質(zhì)[15]。Herrera-Hernández研究了墨西哥薩卡特卡斯半干旱條件下生長的大豆，發(fā)現(xiàn)其具有豐富的生物活性物質(zhì)和較強(qiáng)抗氧化能力[16]。曹柏營等研究發(fā)現(xiàn)黑豆花青素對鐵離子螯合劑和羥基自由基有較高的清除力[17]。鞏藹等研究了云南8種特色豆，表明其具有較高的總多酚含量和較強(qiáng)的抗氧化性能[18]。程安瑋等研究表明蠶豆等4種豆類中的結(jié)合態(tài)多酚具有較高的抗氧化性[19]。王德萍等研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆乙醇提取物具有一定的降血糖作用[20]。任嬌艷等研究表明白扁豆水提物對幽門螺桿菌損傷人胃黏膜上皮細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用[21]。

本研究以黑豆、綠豆、紅小豆、大豆和豇豆5種豆類為研究材料，比較其乙醇提取物總多酚和總黃酮含量及4種體外抗氧化活性，進(jìn)行相關(guān)性分析，為我國豆類資源的開發(fā)利用和豆類保健品的研制提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆、綠豆、紅小豆、大豆、豇豆：市售，優(yōu)質(zhì)且含水量＜5%。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚：上海源葉生物科技有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海生工生物工程股份有限公司；硫酸亞鐵七水合物：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、水楊酸、抗壞血酸、過氧化氫、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；D-37520型臺(tái)式離心機(jī)：德國賽默飛世爾科技公司；FA1004電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-2A型電熱恒溫水浴鍋、FW-200型高速萬能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；DZC-403型真空干燥箱：天津天宇機(jī)電儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的制備

豆類樣品于60℃烘干10 h，粉碎成末后過60目篩，準(zhǔn)確稱取2 g樣品粉末，按1∶10（g/mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，以250 r/min的轉(zhuǎn)速60℃下恒溫振蕩提取2 h，7 000 r/min離心8 min，取上清液，殘?jiān)谙嗤瑮l件下重復(fù)提取1次，合并兩次上清液并定容備用，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 豆類中總多酚含量的測定

1.3.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[22]繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程：Y=139.39X+0.026，回歸系數(shù)R2=0.995 3。

式中：Y為吸光度；X為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg/mL。

1.3.2.2 總多酚含量測定

準(zhǔn)確吸取1 mL樣品溶液于25 mL的具塞試管中；分別加入福林酚試劑1 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉溶液2 mL并定容至刻度線，室溫25℃下避光反應(yīng)2 h；在765 nm波長處測定樣品的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式得出豆類總多酚的含量?？偠喾雍康挠?jì)算公式如下。

式中：P為豆類總多酚含量（以沒食子酸計(jì)），mg/g；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所算得反應(yīng)液總多酚濃度，mg/mL；V為反應(yīng)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為所稱取的豆粉質(zhì)量，g。

1.3.3 豆類中總黃酮含量的測定

1.3.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[23]繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程：Y=10.736X+0.007 1，回歸系數(shù)R2=0.998 7。

式中：Y為吸光度；X為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg/mL。

1.3.3.2 總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL放置于10 mL的容量瓶中；加3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，再用70%的乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min；在510 nm下測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式得出豆類總黃酮的含量。總黃酮含量的計(jì)算公式如下。

式中：P為豆類總黃酮含量（以蘆丁計(jì)），mg/g；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所算得反應(yīng)液總黃酮濃度，mg/mL；V為反應(yīng)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為所稱取的豆粉質(zhì)量，g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

準(zhǔn)確移取0.5 mL樣品溶液于試管內(nèi)，再取兩支空試管，向其中分別加入0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），然后向各試管分別加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，混合均勻后于37℃恒溫避光水浴30 min，冷卻至室溫25℃，測定波長515 nm處的OD值。

DPPH·清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.5 羥基自由基（·OH）清除能力的測定

取樣品溶液0.5 mL置于試管內(nèi)，再取兩支空試管，向其中分別加入0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），各試管再分別加入0.15 mmol/L FeSO4溶液 1 mL、2 mmol/L 水楊酸 0.4 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL及蒸餾水0.4 mL，振蕩搖勻，37℃下恒溫水浴1 h，冷卻至室溫25℃，測定波長510 nm處的OD值。

·OH 清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.6 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

取3支干燥潔凈的試管分別加入0.2 mol/L的Tis-HCL緩沖液（pH 8.2）4.0 mL，再各加入 0.5 mL樣品液、0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），混勻后，置于25℃恒溫水浴，反應(yīng)4 min后立即加2滴8 mol/L的HCL終止反應(yīng)，并測定波長為420 nm處的OD值。

O2-·清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.7 過氧化氫（H2O2）清除能力測定

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）將H2O2配置成40 mmol/L的H2O2溶液，取3支試管分別加入0.6 mL配置好的H2O2溶液，再向其中各加入3.4 mL樣品溶液、3.4 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和3.4 mL蒸餾水（空白），混勻，230 nm處測定其OD值。

H2O2清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有處理均重復(fù)3次，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆類中總多酚和總黃酮含量比較

5種豆類的總多酚和總黃酮含量見表1。

表1 5種豆類中總多酚和總黃酮含量Table 1 The contents of total polyphenols and total flavonoids in five samples

由表1可知，5種不同豆類的總多酚含量存在一定差異，其中黑豆總多酚含量最高，其含量高達(dá)6.33mg/g，這可能與黑豆皮中含有比較多的花青素有關(guān)，其次是紅小豆，總多酚含量為3.73 mg/g，綠豆、大豆和豇豆的總多酚含量較低，在2.05 mg/g～2.18 mg/g范圍內(nèi)，且3者之間的總多酚含量差異不顯著（P＞0.05）。

從表1可以看出，5種不同豆類的總黃酮含量也存在一定差異，其中黑豆總黃酮含量最高，為4.09 mg/g，其次為紅小豆和豇豆（分別為2.61 mg/g和2.08 mg/g），綠豆和大豆的總黃酮含量較低，且二者之間不存在顯著差異（P＞0.05），分別為 1.51 mg/g和 1.50 mg/g。由表1可知，5種豆類的總黃酮含量都低于其總多酚含量，這是可能由于大多數(shù)的黃酮類化合物都屬于多酚類物質(zhì)。

2.2 5種豆類的抗氧化活性比較

各種抗氧化成分的抗氧化機(jī)理不同[24]，由于不同豆類的抗氧化活性成分及含量有一定差異，所以要研究其抗氧化活性需要綜合不同的檢測方法，本研究通過對 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力來分析5 種豆類的抗氧化活性，具體結(jié)果見表2。

表2 5種不同豆類的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of five different samples

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH·是一種非常穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于天然成分的體外抗氧化活性研究，在自由基清除劑（如多酚類、黃酮類物質(zhì)）存在下，其溶液會(huì)由深紫色逐漸變?yōu)闇\黃色或無色，通過觀察515 nm處吸光度值的變化就可以計(jì)算某物質(zhì)的DPPH·清除率[25]。

5種不同豆類對DPPH·的清除率見圖1。

圖1 5種不同豆類對DPPH·的清除率Fig.1 DPPH·clearance rates of five different samples

從表2和圖1可以看出不同豆類DPPH·清除率有明顯差異，其中清除率最高的是黑豆，高達(dá)80.92%，這可能與黑豆中含有較高的總多酚和總黃酮有關(guān)，其次是紅小豆和綠豆，清除率也比較高，分別為72.21%和72.02%，且二者不存在顯著差異（P＞0.05），豇豆和大豆的清除率略低，分別為59.41%和54.54%，且二者差異顯著（P＜0.05）。

2.2.2 羥基自由基清除能力

·OH是一種非常重要的活性氧，具有極強(qiáng)氧化性即得電子能力，所以對生物體毒害作用非常強(qiáng)，可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷和各種疾病[24]。

5種不同豆類對·OH的清除率見圖2。

圖2 5種不同豆類對·OH的清除率Fig.2·OH clearance rates of five different samples

如表2和圖2顯示，5種不同豆類·OH清除率具有顯著差異（P＜0.05），其中大豆的清除率最高，為87.11%，其次是黑豆、紅小豆和綠豆，分別為77.42%、73.25%和69.02%，豇豆的·OH清除率最低，為52.13%。

2.2.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力

O2-·是一種活性氧自由基，可以導(dǎo)致人體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快衰老，并誘發(fā)各種皮膚病、癌癥和心血管疾病等，嚴(yán)重?fù)p害人體健康，O2-·在人體內(nèi)可以被超氧化物歧化酶和攝入的一些抗氧化劑清除[26]。

5種不同豆類對O2-·的清除率見圖3。

圖3 5種不同豆類對O2-·的清除率Fig.3 O2-·clearance rates of five different samples

由表2和圖3可以看出，5種不同豆類O2-·清除率也存在顯著差異（P＜0.05），其中黑豆的清除率最高，高達(dá)81.62%，其次是紅小豆、豇豆和大豆，分別為75.60%、68.95%和56.98%，綠豆的O2-·清除率最低，為54.57%。

2.2.4 過氧化氫（H2O2）清除能力

按結(jié)構(gòu)劃分H2O2并不屬于自由基范疇，但其對人體的損傷作用與自由基相似，主要體現(xiàn)在對人體生命大分子的損害，是造成衰老和疾病的重要原因之一[24]。目前體外H2O2清除能力測定的方法主要是分光光度法[24]。

5種不同豆類對H2O2的清除率見圖4。

由表2和圖4可知，5種不同豆類的H2O2清除率相比前3種自由基的清除率來說都不高，清除率最大的是豇豆，為39.58%，其次為紅小豆，清除率38.06%，大豆和黑豆的H2O2清除率差異不顯著（P＞0.05），分別為36.79%和36.73%，清除率最低的是綠豆，為35.45%。

2.3 豆類中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對5種不同豆類總多酚、總黃酮含量及其 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2清除能力之間進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，所得Pearson相關(guān)系數(shù)及雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

圖4 5種不同豆類對H2O2的清除率Fig.4 H2O2clearance rates of five different samples

表3 豆類總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性Table 3 The coefficients among the contents of total polyphenols，total flavonoids and the antioxidant activity of five samples

由表3可以看出，5種不同豆類的總多酚含量和總黃酮含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于大多數(shù)黃酮類化合物都屬于多酚類物質(zhì)；豆類總多酚含量與DPPH·、·OH和O2-·清除率之間都呈正相關(guān)，其中與DPPH·和O2-·清除率之間的相關(guān)性比較高；豆類總黃酮含量和四種抗氧化活性之間都呈正相關(guān)，其中與 O2-·清除率之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與DPPH·清除率的相關(guān)性也比較高。

3 結(jié)論

對黑豆、綠豆、紅小豆、大豆和豇豆5種豆類的總多酚、總黃酮含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5種不同豆類的總多酚含量在2.05 mg/g～6.33 mg/g的范圍內(nèi)，總黃酮含量在1.50 mg/g～4.09 mg/g的范圍內(nèi)，其含量在不同豆類間存在明顯差異，其中黑豆的總多酚和總黃酮含量都最高，分別為6.33 mg/g和4.09 mg/g。

采用4個(gè)指標(biāo)對4種豆類進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同豆類對 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力存在明顯差異，這可能是由于不同豆類所含的抗氧化成分不同，以致其抗氧化機(jī)理也不盡相同。5種豆類對DPPH·、·OH和O2-·的清除率都比較高，其中黑豆的清除力最強(qiáng)，對3種自由基的清除能力分別為80.92%、77.42%和81.62%。

相關(guān)性分析表明5種豆類的總多酚和總黃酮含量之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于大多數(shù)黃酮類化合物都屬于多酚類物質(zhì)。這兩種活性成分含量與DPPH·、·OH和O2-·清除能力之間都呈正相關(guān)，其中總黃酮含量和O2-·清除能力之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

綜上，5種豆類含有豐富的多酚類和黃酮類物質(zhì)，并具有較強(qiáng)的抗氧化性能，這將為豆類保健品的研制和天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供參考。