王碧瑩 李應(yīng)東 劉永琦

【摘 要】 目的：通過(guò)地龍降壓膠囊對(duì)SHR大鼠凝血相關(guān)的血小板miRNAs表達(dá)的影響，探討地龍降壓膠囊的降壓機(jī)制。方法：SHR大鼠分為5組：正常對(duì)照組、肝素陽(yáng)性對(duì)照組、地龍降壓膠囊低、中、高劑量組。藥物高、中、低組分別灌胃地龍降壓膠囊100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg。15d后取血，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測(cè)5種miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，地龍降壓膠囊干預(yù)組與血小板活化相關(guān)的miRNA-223、miRNA-96和聚集相關(guān)的miRNA-130a的表達(dá)量明顯改變，而與血小板生成有關(guān)的miRNA-155、miRNA34a-5p的表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)論：地龍降壓膠囊可能主要通過(guò)影響血小板活化與聚集相關(guān)的miRNAs發(fā)揮抗凝血降壓作用。

【關(guān)鍵詞】 地龍降壓膠囊;miRNAs;凝血相關(guān)

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）1-0013-08

Abstract：Objective To explore the hypotensive mechanism of Dilong antihypertension Capsule， based on the investigations of the expressions of miRNAs coagulation-related platelets after the administration of Dilong antihypertension Capsule. Methods SHR rats were randomly divided into 5 groups： normal control group， heparin- positive control group， low-dose group of Dilong antihypertension Capsule， medium-dose group of Dilong antihypertension Capsule， high-dose group of Dilong antihypertension Capsule. The high， medium and low-dose groups were respectively given Dilong antihypertension Capsule 100mg/kg， 50mg/kg and 25mg/kg. Bloods were collected 15 days after administration， and the expressions of five miRNAs were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-PCR）. Results Compared with the control group， the expressions of platelet activation-related miRNA-223， miRNA-96 and conglomeration-related miRNA-130a in Dilong antihypertension Capsule-treated groups changed significantly， while there was no obvious change in the expressions of miRNA-155 and miRNA34a-5p related to thrombocytopoiesis. Conclusion Dilong antihypertension Capsule may play an anticoagulant and hypotensive role mainly by affecting the miRNAs expressions of platelet activation and aggregation.

Keywords：Dilong antihypertension Capsule; miRNAs; Coagulation-related

地龍是傳統(tǒng)中藥，具有通經(jīng)活絡(luò)的功效，常用于治療經(jīng)脈不暢等病癥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)地龍具有抗凝血、改善血液循環(huán)等作用[1]。臨床運(yùn)用地龍降壓膠囊治療高血壓有一定的療效，但其降壓機(jī)制尚不明確。研究表明老年性高血壓和妊娠性高血壓與血小板活化有一定的聯(lián)系，此類高血壓患者普遍處于高凝狀態(tài)，血壓升高時(shí)易引起血管內(nèi)皮損傷，促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放活性物質(zhì)，引起血小板聚集，導(dǎo)致血小板血栓形成[2]。研究通過(guò)地龍降壓膠囊對(duì)幾種凝血相關(guān)的血小板miRNAs的影響，探討其降壓機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，8周齡，SPF級(jí)，雄性，實(shí)驗(yàn)期間給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食飲水。

1.1.2 儀器 QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI）;Nano-100微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）;熒光定量PCR管（EXTRAGENE）;EDC-810 PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）;JY300水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）;JY02S紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.1.3 藥物與試劑 地龍降壓膠囊（批號(hào)：151026，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑）;Trizol（批號(hào)：15596-026，Ambion）;HiScript Reverse Transcriptase（批號(hào)：R101-01/02，VAZYME）;5×HiScript Buffer（批號(hào)：R101-01/02，VAZYME）;ddH2O（批號(hào)：C1D230A，genecopoeia）;Ribonuclease Inhibitor（批號(hào)：LOT#J11202，Tr-ansGen）;dNTP Mixture（批號(hào)：LOT#M1123，TIANGEN）;50×ROX Reference Dye 2（批號(hào)：Cat.#D01011A，VAZYME）;SYBR Green Master Mix（批號(hào)：Cat.#D01010A，VAZYME）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥

參考文獻(xiàn)[3]將SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后測(cè)血壓，按照收縮壓值隨機(jī)分為5組，每組8只：①正常對(duì)照組：等體積蒸餾水灌胃;②肝素陽(yáng)性對(duì)照組：肝素500IU/kg尾靜脈注射，每日1次;③地龍降壓膠囊低劑量組;④地龍降壓膠囊中劑量組;⑤地龍降壓膠囊高劑量組;以上三組

參考文獻(xiàn)[4]分別灌胃地龍降壓膠囊25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg（膠囊內(nèi)干粉溶于37℃溫水），每日2次，早晚各1次。以上各組共處理15d后處死大鼠，取血液保存。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，8倍稀釋后應(yīng)用qPCR檢測(cè)血小板相關(guān)5種miRNAs變化水平，計(jì)算公式為Folds=2-△△Ct，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。引物序列表如表1所示。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間兩兩比較方差齊者采用LSD比較，方差不齊者采用Dunnett，t檢驗(yàn)，以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-223的表達(dá) 各組的熔解曲線為單峰，沒(méi)有出現(xiàn)雜峰和主峰的異常增寬，說(shuō)明模板濃度合理;擴(kuò)增曲線提示擴(kuò)增效率良好。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-223能夠作用于P2Y12蛋白從而激活血小板的活化功能[5-6]，其表達(dá)量下降時(shí)抗凝血功能增強(qiáng)。由圖1可知，地龍降壓膠囊高劑量組的miRNA-223的表達(dá)量比正常對(duì)照組顯著降低（正常：高劑量，1∶ 0.539）（P<0.01），肝素陽(yáng)性對(duì)照組的miRNA-223也出現(xiàn)類似的情況，提示藥物干預(yù)會(huì)造成血小板活性降低。2.2 miRNA-96的表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)囊泡相關(guān)膜蛋白-8（vesicle associated membrane protein8，VAMP-8）可激活血小板的活化，miRNA-96可通過(guò)降低其含量抑制血小板活化[7]，其表達(dá)上調(diào)具有抗凝血的作用。由圖2可知，地龍降壓膠囊高、中、低劑量干預(yù)后miRNA-96表達(dá)量分別是正常對(duì)照組的7.56、4.45、2.46倍（P<0.01），可能藥物干預(yù)后血小板的活化被抑制。2.3 miRNA-130a的表達(dá) 體內(nèi)外研究表明，糖蛋白Ⅱb可促進(jìn)血小板的聚集，miRNA-130a通過(guò)減少其基因表達(dá)從而影響血小板的聚集過(guò)程[8]。由圖3可知，肝素陽(yáng)性對(duì)照組和地龍降壓膠囊高劑量組的miRNA-130a表達(dá)量明顯升高，分別是空白組的5.989倍、5.495倍（P<0.01），說(shuō)明地龍降壓膠囊對(duì)血小板的聚集明顯有抑制作用。2.4 miRNA-155的表達(dá) miRNA-155在造血干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能抑制巨核細(xì)胞生成、分化，從而抑制血小板產(chǎn)生[9]。由圖4可知，與空白對(duì)照組相比，其余各組的miRNA-155表達(dá)量無(wú)明顯差異（P>0.05），分別是1.136、0.983、1.717、1.054，證明地龍降壓膠囊對(duì)血小板產(chǎn)生沒(méi)有抑制性影響。2.5 miRNA34a-5p的表達(dá) ICHIMURA等發(fā)現(xiàn)miRNA34a-5p能促進(jìn)巨核細(xì)胞生成，從而提高血小板生成[10]。由圖5可知，地龍降壓膠囊高中低劑量干預(yù)組miRNA34a-5p的表達(dá)量跟正常對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），可能地龍降壓膠囊對(duì)血小板的生成無(wú)促進(jìn)作用。

3 討論

地龍別名蚯蚓，《本草綱目》記載：“性寒而下行，性寒故能解諸熱疾，下行故能利小便，治足疾而通經(jīng)絡(luò)也”。此藥歸肝、脾、膀胱經(jīng)，能通絡(luò)平喘，適用于多種原因?qū)е碌慕?jīng)絡(luò)阻滯、血脈不暢等癥狀。

高血壓患者常伴有凝血功能的改變，周身微小血管暴露在高血壓病理狀態(tài)下，易出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)血小板的活化作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者的平均血小板體積（MPV）增大，血壓與MPV成正比，代表血小板活性增強(qiáng)[12]，加速血栓形成。目前，SHR是最接近人類原發(fā)性高血壓病的動(dòng)物模型，其特點(diǎn)為高血壓自發(fā)率100%，在4～6周齡期間自發(fā)形成高血壓，并且表現(xiàn)出持續(xù)性的血壓增高，6個(gè)月可至最高水平。既往研究發(fā)現(xiàn)，SHR動(dòng)物模型與人類原發(fā)性高血壓的病理基礎(chǔ)相似，存在高凝及纖溶亢進(jìn)狀態(tài)[13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用SHR為研究對(duì)象進(jìn)行探討。

地龍降壓膠囊的主要成分為地龍蛋白提取物，具有溶血栓和抗凝血功效[15]。富含纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶等，影響體內(nèi)的凝血系統(tǒng)[16]。本研究中將miRNAs作為指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)地龍降壓膠囊對(duì)血小板的影響，研究首先涉及與血小板活化作用相反的兩種miRNAs：miRNA-223通過(guò)Ago2-mir-223復(fù)合物調(diào)節(jié)P2Y12（腺苷二磷酸受體）的表達(dá)，從而啟動(dòng)血小板的活化[17]，而miRNA-96可以通過(guò)降低VAMP-8的含量降低血小板的活化[18]。地龍降壓膠囊干預(yù)后miRNA-223的表達(dá)量下降（見(jiàn)圖1），miRNA-96的表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖2），表明地龍降壓膠囊對(duì)血小板的活化有一定抑制作用，通過(guò)對(duì)血小板活化的抑制抗凝血。對(duì)miRNA-130a的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)明顯上調(diào)（見(jiàn)圖3），miRNA-130a是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子MAFB的表達(dá)，減少糖蛋白Ⅱb基因表達(dá)，從而抑制血小板的聚集[19]。結(jié)果說(shuō)明地龍降壓膠囊可能通過(guò)促進(jìn)miRNA-130a的表達(dá)，進(jìn)而抑制血小板的聚集。

另外，研究也涉及到與血小板生成相關(guān)的兩種miRNAs：miRNA-155和miRNA34a-5p。miRNA-155通過(guò)抑制巨核細(xì)胞的生成、分化，從而抑制血小板產(chǎn)生，而miRNA34a-5p通過(guò)促進(jìn)巨核細(xì)胞生成的途徑提高血小板生成。研究表明，地龍降壓膠囊干預(yù)后，miRNA-155和miRNA34a-5p的表達(dá)沒(méi)有明顯變化（見(jiàn)圖4和5），表明地龍降壓膠囊可能對(duì)血小板的產(chǎn)生既無(wú)抑制作用也無(wú)促進(jìn)作用，說(shuō)明地龍降壓膠囊沒(méi)有通過(guò)影響血小板生成發(fā)揮抗凝血作用。

綜上，地龍降壓膠囊主要引起血小板活化和聚集相關(guān)的miRNAs的表達(dá)改變，而與血小板生成相關(guān)的miRNAs沒(méi)有太大變化，證明地龍降壓膠囊可能主要通過(guò)抑制血小板活化與聚集而降低凝血作用，進(jìn)而發(fā)揮降壓機(jī)制。進(jìn)一步探討miRNAs在凝血中的作用，尤其是對(duì)于與凝血異常相關(guān)的老年性高血壓的控制有一定的臨床意義。

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（收稿日期：2019-10-28 編輯：程鵬飛）