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      高溫米糠粕中蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)化

      2020-04-09 07:27:42楊華宣麗權(quán)志中楊寧梁麗萍宗緒巖
      中國(guó)果菜 2020年3期
      關(guān)鍵詞:堿法米糠堿性

      楊華,宣麗*,權(quán)志中,楊寧,梁麗萍,宗緒巖

      (1.沈陽(yáng)市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)服務(wù)中心<沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院>,遼寧 沈陽(yáng) 110025;2.沈陽(yáng)市康普利德生物科技有限公司,遼寧 沈陽(yáng) 110161;3.遼寧康普利德生物科技有限公司,遼寧 鐵嶺 112600;4.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院,四川 宜賓 644000)

      米糠是指糙米碾下的皮層,蛋白質(zhì)含量一般在12%~15%[1]。米糠粕是米糠經(jīng)浸出、脫脂處理后的產(chǎn)物,蛋白含量在15%以上,通過(guò)加熱膨化、浸取油脂處理可以在保留米糠營(yíng)養(yǎng)特性、滅活抗?fàn)I養(yǎng)因子的同時(shí)延長(zhǎng)保質(zhì)期[2]。因此,米糠粕更適合作為綜合開(kāi)發(fā)利用的原料。高溫米糠粕是米糠經(jīng)過(guò)高溫提油之后的副產(chǎn)品。目前世界上每年生產(chǎn)米糠油50 萬(wàn)t,中小企業(yè)生產(chǎn)米糠油時(shí)采用高溫提油工藝,而且米糠容易氧化酸敗,在4~6 h 內(nèi)必須進(jìn)行加工達(dá)到熱穩(wěn)定化,因此市面上大部分的米糠粕屬于高溫粕[3]。

      米糠粕在熱穩(wěn)定化加工過(guò)程中蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性,導(dǎo)致可溶性蛋白減少,給米糠蛋白的提取帶來(lái)困難。國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于米糠深加工的研究報(bào)道[4],例如從米糠中直接提取功能性物質(zhì)制備功能性食品、利用微生物發(fā)酵米糠實(shí)現(xiàn)其增值轉(zhuǎn)化,但鮮有關(guān)于高溫米糠粕綜合利用的研究。目前,米糠蛋白的提取方法主要有堿法、物理法、酶法以及物理法結(jié)合酶法[5]。其中,堿法提取是公認(rèn)的工藝簡(jiǎn)便、提取率較高的一種方法[6]。超聲波提取法具有提取效率高、操作方便、溫度低、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[7]。酶法反應(yīng)條件溫和、蛋白提取得率較高,且能更多地保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。馬永強(qiáng)等[8]的研究表明,堿性蛋白酶對(duì)高溫米糠粕的水解效果較為突出;李東銳等[9]研究發(fā)現(xiàn),超聲波處理有助于米糠粕中米糠蛋白的提取,超聲功率的變化對(duì)米糠蛋白的提取率影響不大,而超聲處理時(shí)間影響相對(duì)較大,處理20 min 時(shí)蛋白提取率達(dá)到最大。

      前期試驗(yàn)通過(guò)各活性物質(zhì)提取順序的研究,確定了適宜高溫米糠粕綜合利用的工藝順序,即提取植酸鈣→糖化酶除淀粉→提取蛋白質(zhì)→提取多糖。此工藝順序不僅最大程度避免了各活性物質(zhì)間的相互影響,而且提高了蛋白質(zhì)和多糖的質(zhì)量[10]。本試驗(yàn)以提取植酸鈣、除淀粉后的高溫米糠粕為原料,分別采用堿法、堿法-物理法(超聲波)、堿法-物理法-酶法(超聲波+堿性蛋白酶)三種方法提取蛋白質(zhì),以期在相對(duì)溫和的反應(yīng)條件下優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝,從而為高溫米糠粕的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      米糠粕:采購(gòu)于沈陽(yáng)金稻飼料有限公司。

      硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、硼酸、糖化酶、堿性蛋白酶(活力2.0×105U/g)、濃硫酸、濃鹽酸、碘、碘化鉀、氫氧化鈉等試劑,均為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      UV-1700 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;HJ-M6 型水循環(huán)磁力攪拌水浴鍋,金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠;STARTER 3100 型pH 計(jì),上海奧豪斯儀器有限公司;CP 214 型電子天平,上海奧豪斯儀器有限公司;K9860 型全自動(dòng)凱氏定氮儀,海能儀器;SC-3614 型低速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;101FA-0 型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海樹立儀器儀表有限公司。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 米糠粕前處理

      (1)提取植酸鈣

      按照料液比1:10(g:mL),在室溫下提取1 h,提取溶劑為1 mol/L 鹽酸,對(duì)米糠粕進(jìn)行處理。提取結(jié)束后,離心,沉淀備用。

      (2)糖化酶除淀粉

      將1.3.1(1)中的沉淀,按照糖化酶添加量2%(糖化酶質(zhì)量/米糠粕原料質(zhì)量),料液比1:10(按米糠粕原料的質(zhì)量計(jì)),溫度60 ℃,pH 4.0~4.5,酶解4 h 進(jìn)行處理,滅酶,離心,沉淀備用。

      1.3.2 米糠粕蛋白提取

      (1)米糠粕蛋白堿法提取

      1.3.1(2)中的沉淀→按照料液比1:10(按米糠粕原料的質(zhì)量計(jì))加入蒸餾水→調(diào)節(jié)適當(dāng)pH→水浴溫度50 ℃,攪拌時(shí)間2 h→4 000 r/min 離心10 min,所得上清液處理方式分為步驟①②。

      步驟①上清液用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6[8]→靜置過(guò)夜→10 000 r/min 離心10 min→取沉淀物→干燥。

      步驟②沉淀物繼續(xù)在料液比為1:10 的水中、適當(dāng)?shù)膒H 值溫度50 ℃條件下,2 h 分別提取2 次、3 次→4 000 r/min 離心10 min →上清液處理方法同步驟①。

      (2)米糠粕蛋白不同提取方法的比較

      堿法:料液比1:10,pH 值為11,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間4 h。

      堿法+超聲波:料液比1:10,pH 值為11,超聲功率60 W,超聲時(shí)間20 min,超聲提取結(jié)束后,水浴提取溫度50℃,提取時(shí)間4 h。

      堿法+超聲波+堿性蛋白酶:料液比1:10,pH 值為11,超聲功率60 W,超聲時(shí)間20 min,超聲提取結(jié)束后采用酶法提取,堿性蛋白酶添加量2.5%,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間4 h。

      提取結(jié)束后,滅酶,離心,上清液用1 mol/L 的鹽酸調(diào)整pH 為3.6,靜置過(guò)夜,沉淀離心后干燥,即得蛋白質(zhì)樣品。

      1.3.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗(yàn)

      在研究中發(fā)現(xiàn),米糠粕具有較強(qiáng)的pH 緩沖作用,另外隨著酶解作用的進(jìn)行,樣品pH 值也會(huì)發(fā)生變化,所以本試驗(yàn)以酶解反應(yīng)結(jié)束后,蛋白提取液的pH 值作為監(jiān)測(cè)指標(biāo),研究不同酶解工藝對(duì)米糠蛋白提取效果的影響。

      (1)堿性蛋白酶添加量對(duì)米糠蛋白得率的影響

      精確稱取50.0 g 米糠粕若干份,首先按照1.3.1 項(xiàng)進(jìn)行前處理,離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水,用10%氫氧化鈉調(diào)樣品pH 值為11,超聲功率60 W,超聲時(shí)間20 min,超聲提取結(jié)束后進(jìn)行酶法提取,堿性蛋白酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,溫度50 ℃,提取時(shí)間3 h。提取結(jié)束后,滅酶,離心,上清液測(cè)定pH 值,然后用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6,靜置過(guò)夜,沉淀離心后干燥,即得蛋白質(zhì)樣品,然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

      (2)堿性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)米糠蛋白得率的影響

      堿性蛋白酶添加量為1.5%,溫度50 ℃,提取時(shí)間分別為1、2、3 h。采用堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白,即得蛋白質(zhì)樣品,然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

      (3)酶解結(jié)束后pH 值對(duì)米糠蛋白得率的影響

      精確稱取50.0 g 米糠粕若干份,首先按照1.3.1 項(xiàng)進(jìn)行前處理,離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水,樣品pH 值在堿性范圍內(nèi)呈現(xiàn)梯度,以保證酶解后pH 值分別為7.5、8.5、9.5、10.5、11.5,超聲功率60 W,超聲時(shí)間20 min,超聲提取結(jié)束后酶法提取,堿性蛋白酶添加量1.5%,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間1 h。提取結(jié)束后,滅酶,離心,上清液測(cè)定pH 值,然后用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6,靜置過(guò)夜,沉淀離心后干燥,即得蛋白質(zhì)樣品,然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

      1.3.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的正交試驗(yàn)

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

      表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

      1.3.5 米糠蛋白的測(cè)定方法

      采用GB5009.5《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定米糠蛋白樣品中蛋白質(zhì)的含量。按照公式(1)計(jì)算蛋白質(zhì)得率,按照公式(2)計(jì)算蛋白提取率。

      表2 pH 和提取次數(shù)對(duì)米糠蛋白得率的影響Table 2 The effect of pH and extraction time on the yield of rice bran protein

      式中:m1為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量,g;m2為原料質(zhì)量,g。

      式中:m3為米糠蛋白樣品得率,%;m4為米糠蛋白樣品的蛋白含量,%。

      1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理

      使用IBM SPSS Statistics 20 軟件分析和處理數(shù)據(jù)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 米糠粕蛋白堿法提取

      由表2 可以看出,pH 對(duì)米糠蛋白提取有較大影響。pH 值為8 時(shí),第1 次提取,得率僅為0.12%;pH 值為9時(shí),第1 次提取,得率提高到0.58%;pH 值為10 時(shí),第1次提取,得率提高到1.28%,超過(guò)了pH 值為8 時(shí)3 次提取的蛋白得率總和;pH 值為11 時(shí)第1 次提取,得率提高到1.83%,超過(guò)了pH 值為9 時(shí)3 次提取的蛋白得率總和。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇pH 值為11。

      可見(jiàn),通過(guò)增加提取次數(shù)和調(diào)整pH 值,也僅使米糠蛋白的得率從0.12%提高到2.90%,考慮到增加提取次數(shù)會(huì)大量增加生產(chǎn)成本,降低提取效率,而且對(duì)于經(jīng)熱穩(wěn)定化浸提米糠油的糠粕,堿法的提取效率也會(huì)大打折扣[11],所以對(duì)高溫米糠粕進(jìn)行不同提取技術(shù)的復(fù)合處理很有必要。

      2.2 米糠粕蛋白不同提取方法的比較

      由表3 可以看出,超聲波輔助堿法提取較堿法提取,蛋白得率提高了0.22%,堿法+超聲波+堿性蛋白酶較堿法提取,蛋白得率提高了2.00%。雖然堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取的蛋白含量有所下降,但蛋白提取率還是高于堿法0.61%、高于堿法+超聲波法0.48%。故高溫米糠粕綜合利用研究中,蛋白質(zhì)的提取方法選擇堿法+超聲波+堿性蛋白酶法。

      表3 不同提取方法對(duì)米糠蛋白提取效果的影響Table 3 The effect of extraction methods on the yield of rice bran protein

      2.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗(yàn)

      2.3.1 堿性蛋白酶添加量對(duì)米糠蛋白得率的影響

      由圖1 可以看出,蛋白得率一方面和堿性蛋白酶的添加量有關(guān),另一方面和酶解反應(yīng)結(jié)束后的pH 值有關(guān)。酶解反應(yīng)結(jié)束后的pH 值越低,蛋白得率相對(duì)越低,當(dāng)堿性蛋白酶添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%時(shí),蛋白得率相對(duì)較高,因此,選擇這三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

      2.3.2 堿性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)米糠蛋白得率的影響

      由圖2 可以看出,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白得率先升高后下降,在酶解時(shí)間為2 h 時(shí),蛋白得率最高,為4.31%,而酶解后pH 值隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),因此,選擇堿性蛋白酶的最佳酶解時(shí)間為2 h。

      2.3.3 酶解結(jié)束后pH 值對(duì)米糠蛋白得率的影響

      圖3 顯示了酶解結(jié)束后不同pH 值對(duì)米糠蛋白得率和含量的影響。由圖3 可以看出,酶解反應(yīng)結(jié)束后,蛋白提取液的pH 值越高,蛋白得率越高,蛋白含量也越高。隨著pH 值從7.5 增加到11.5,蛋白得率從2.56%提高到6.16%,蛋白含量從57.5%提高到70.0%。雖然隨著酶解后pH 的增加,蛋白得率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì),但堿液濃度過(guò)高,蛋白質(zhì)中賴氨酸與丙氨酸、胱氨酸易發(fā)生縮合反應(yīng),生成有毒化合物,使賴氨酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅降低[5]。為了兼顧蛋白得率和營(yíng)養(yǎng),選擇酶解后pH 值10.5、11.0、11.5 這三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

      2.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白正交試驗(yàn)

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4,方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

      從表4、5 中的數(shù)據(jù)分析可知,三個(gè)因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素,影響順序依次為酶解時(shí)間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值;提取米糠蛋白的最佳條件是A2B1C2,即蛋白酶添加量1.5%、酶解時(shí)間1 h、酶解后pH 值11.0。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn),該條件下得到的米糠蛋白得率為7.10%,高于其他試驗(yàn)組;此時(shí)蛋白含量為70.5%。本試驗(yàn)通過(guò)工藝優(yōu)化,使米糠蛋白在獲得高得率的同時(shí)保證了較高的蛋白含量。

      表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

      表5 正交試驗(yàn)方差分析Table 5 The variance analysis of orthogonal test

      3 討論

      高溫米糠粕中的可溶性蛋白比例較低,其氮溶解指數(shù)(Nitrogen soluble index,NSI)僅為11.6%,屬高變性蛋白[12]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)米糠蛋白未優(yōu)化提取條件之前,得率僅為0.12%,這限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。本文通過(guò)優(yōu)化堿法+超聲波+堿性蛋白酶的提取工藝,確定了高溫米糠粕綜合利用工藝中米糠蛋白的最優(yōu)提取條件為堿性蛋白酶添加量1.5%、酶解時(shí)間1 h、酶解后pH 值11.0。三個(gè)因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素,影響順序依次為酶解時(shí)間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值。在此條件下,米糠蛋白得率為7.10%,蛋白含量為70.5%。

      王丕新[13]通過(guò)考察歐美幾個(gè)稻谷加工廠,以及日本、韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家米糠蛋白制取的先進(jìn)工藝,也整理出工業(yè)化米糠蛋白制取的工藝為兩次堿液浸出,他提出,未來(lái)有望在米糠蛋白制取工藝方面,結(jié)合酶法和高溫噴射蒸煮等更先進(jìn)的技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)米糠蛋白的全面工業(yè)化制取。他還指出,工業(yè)化生產(chǎn)米糠蛋白的原料為低溫脫脂米糠,限制了高溫米糠粕的應(yīng)用。本文的研究證實(shí)了堿法+超聲波+堿性蛋白酶法提高高溫米糠粕蛋白提取率的可行性。有研究表明,熱穩(wěn)定米糠粕蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后,蛋白的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有所提高[14]。在此基礎(chǔ)上,下一步需要確定不同提取工藝對(duì)米糠蛋白功能性的影響,從而為米糠蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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