張文祺，鄭博升，王昱儼，馬曉玲，王 琳，邱其其，劉 偉

1 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050051；2 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，河北省重大疾病的免疫機(jī)制及干預(yù)重點實驗室，河北石家莊 050017

宮頸癌是全世界婦女第4 大最常見的癌癥，目前超過50 萬女性被診斷患有宮頸癌[1-2]。作為高危人群的高齡婦女及可通過母嬰傳播的孕期女性應(yīng)被重點關(guān)注[3-4]。而宮頸癌的發(fā)病主要與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染有關(guān)[5]。在所有確定的“ 高風(fēng)險”HPV 中，HPV 16 型(HPV16)與HPV18 型(HPV18)占所有子宮頸癌病例的70%以上，其持續(xù)感染是全世界絕大多數(shù)宮頸癌的原因[6-7]。HPV 形態(tài)小，無包膜，為雙鏈DNA 病毒。HPV 基因組可分為三個區(qū)域：長控制區(qū)(long control region，LCR)，早期開放閱讀框(early open reading frames，EORF)和晚期開放閱讀框(late open reading frames，LORF)。而HPV 病毒閱讀框則由以下組成：EORF 中三個參與轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控基因(E1，E2 和E4)；癌基因(E5，E6和E7)；LORF 中兩個編碼自組裝蛋白基因(L1 和L2)。L1、L2 編碼的蛋白質(zhì)可以構(gòu)成病毒衣殼。目前市場上三種HPV 疫苗，都是以非傳染性重組特異性L1 衣殼蛋白為基礎(chǔ)組裝成病毒樣顆粒(viruslike particles，VLP)，并以VLPS 的形式純化作為免疫原，其中九價HPV 疫苗具有預(yù)防高達(dá)90%宮頸癌病例的潛力。高風(fēng)險HPV 中最重要的兩個基因是E6 和E7，這是病毒的關(guān)鍵致癌基因。E6、E7可通過影響p53 抑癌基因和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，PRB)來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8-9]。在宮頸組織中，E7 似乎是產(chǎn)生生殖道癌早期階段的顯性癌基因，而E6 則促進(jìn)腫瘤的后期進(jìn)展。因為這兩種蛋白質(zhì)的序列在廣泛的HPV 亞型中都得到了很好的保護(hù)，所以兩種癌蛋白被認(rèn)為是使用疫苗治療干預(yù)HPV 相關(guān)腫瘤的潛在靶標(biāo)[10]。本文綜合近幾年關(guān)于HPV 疫苗的研究，旨在指出不同表位的特性與優(yōu)缺點，為新疫苗的制備提供參考。

1 L1 相關(guān)表位

L1 是HPV 的主要衣殼蛋白，作為一種潛在的制作疫苗的成分，已經(jīng)得到了廣泛的研究[11]。因為L1 蛋白的互變性與可變性低于L2，且L1 序列內(nèi)的保守區(qū)域中存在的表位多于L2 蛋白，這些區(qū)域?qū)⒆鳛橹泻涂贵w的主要靶標(biāo)[12]。目前已上市三種疫苗(表1)的免疫原均是以非傳染性重組特異性L1 衣殼蛋白為基礎(chǔ)組裝成的VLP，多重的L1結(jié)構(gòu)域能賦予VLP 抗原顯著的免疫原性。免疫原性表位是病毒的重要抗原成分，根據(jù)各自的受體不同，表位可分為B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位，同時表位也可分為線性表位和構(gòu)象表位[13]。

1.1 線性表位 線性表位是由保守氨基酸組成。最近一項實驗發(fā)現(xiàn)可以利用這些線性表位作為工具進(jìn)行疫苗研發(fā)，結(jié)果表明DRB1*1501 和DQB1*0602 等位基因和HLA-DRB1*1501 和DQB1*0602等位基因僅分別與HPV16 和HPV18 宮頸癌陽性相關(guān)。同時預(yù)測了表位序列EEYDLQFIFQLCKITLTA和HPV16 的L1 蛋白的RHGEEYDLQFIFQLCKITLT A、LPDPNKF、PETQRLVWAC、PVPGQYDA、YNP ETQRLVWAC、DTGYGAMD；HPV18L1 蛋白的PV PGQYDATK、KQDIPKVSAYQYRVFRV、RDNVSVD YKQTQLCI 和YSRHVEEYDLQFIF，這些表位均有潛力作為一種工具研制新的HPV 疫苗。同時，這些表位具有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，其免疫原性也隨之增加，但預(yù)測出表位的具體效果仍需更多實驗進(jìn)一步驗證[12]。

1.2 構(gòu)象表位(HPV16) 在HPV 病毒中，HPV16是HPV 生殖器官和口腔癌癥中最常見的致癌基因型，我們以HPV 16 為例闡述L1 構(gòu)象表位研究的最新進(jìn)展。1)H16.U4 相關(guān)：H16.U4 是一種類型特異性單克隆抗體，能被包括L1 蛋白C 末端的HPV的構(gòu)象依賴性中和表位所識別。冷凍電子顯微拷貝圖像重建技術(shù)(CRYO-EM)將HPV16 與抗體(Fab)H16.U4 片段的結(jié)構(gòu)復(fù)合后研究鑒定抗原表位。結(jié)果表明，H16.U4 單克隆抗體在L1 蛋白C 端臂上獨特的結(jié)合模式可以定位一個重要的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象表位，進(jìn)而識別HPV 衣殼不同成熟階段的細(xì)微構(gòu)象變化，為分析病毒感染早期HPV 攝取機(jī)制提供了關(guān)鍵的探針。這些分析準(zhǔn)確地定義了HPV16 衣殼上重要的構(gòu)象表位，是預(yù)防HPV 疫苗成功的關(guān)鍵目標(biāo)，H16 U4 則是研究這些構(gòu)象表位的得力工具[12,14]。2)H16.V5，26d1 相 關(guān)：每 個L1 單 體 的核心都由β 鏈和α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，這些結(jié)構(gòu)支撐著5 個表面暴露的環(huán)形區(qū)域，分別是BC、DE、EF、FG 和HI。不同基因型間的L1 氨基酸序列變異主要集中在表面暴露的環(huán)區(qū)內(nèi)，這段區(qū)域決定了L1 中和抗體的特異性反應(yīng)。L1 蛋白通過FG 和HI 環(huán)的賴氨酸殘基與宿主硫酸肝素部分之間的相互作用介導(dǎo)初級病毒附著。近期CRYO-EM 證明，HPV16 一個單克隆抗體H16.V5 可識別來自兩個相鄰的L1 單體的環(huán)[15]。

表1 中國已上市三種HPV 疫苗相關(guān)信息

單克隆抗體26d1 是一種從記憶B 細(xì)胞中分離出來的人類中和抗體，它對HPV16 有特異性。DE和FG 環(huán)中包含26d1 和H16.V5 相互作用的關(guān)鍵表位。HI 環(huán)也是與H16.V5 相互作用的重要抗原區(qū)，而HPV16-L1 中的DEA 環(huán)也是26d1 的主要抗原識別區(qū)域，DEA 和FGB 環(huán)彼此非常接近，組成了構(gòu)象結(jié)構(gòu)與表位26d1 結(jié)合，可以被識別。DEA 環(huán)135-140(yaanag)和142-143(dn)位置的8 個氨基酸、FGB 環(huán)281-282 位置的2 個氨基酸(gs)和FGB 環(huán)285 位置的殘基ASN(n)被預(yù)測為兩個相鄰L1 單體的構(gòu)象表位，研究在DEA 環(huán)135-136(Ya)處發(fā)現(xiàn)一個線性表位，分析表示DEA 環(huán)上的135-143 殘基主要與26d1 發(fā)生特定的相互作用。通過綜合分析H16V5 和26d1 的復(fù)雜結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，DEA 環(huán)上的4 個 殘 基(ASN 138、ALA 139、ASP 142、ASN 143) 和FGB 環(huán) 的3 個 殘 基(GLY 281、SER 282、ASN 285)都是H16.V5 和26d1 的共有表位[16]。

1.3 B 細(xì)胞和T 細(xì)胞表位研究發(fā)現(xiàn)HPV L1 蛋白中有4 個片段(H2、H4、H11、H12)含B 細(xì)胞表位，三個片段(H2、H3、H9)可能含中和表位。其中H11 和H12 片段中含有B 細(xì)胞表位的情況從未被報道過，H3 首次被發(fā)現(xiàn)為血凝抑制表位。詳細(xì)的表位標(biāo)測確定了HPV16-L1 位置301-310 處的氨基酸序列(tsdaqifnkp)為免疫原性B 細(xì)胞表位[17]。而 在HPV16-L1 中，B 細(xì) 胞 表 位H2(21-54aa)、H4(162-196aa)、H11(89-116aa)和H12(146-167aa)同樣可以被識別。HI(血凝抑制實驗)證實了H2(49-94aa)、H3(111-15aa) 和H9(474-505aa)產(chǎn)生的抗體具有很強(qiáng)的中和作用。這些表位有望作為人乳頭瘤病毒疫苗的候選者。此外，H2 還含有一個關(guān)鍵的中和表位值得關(guān)注，這可能為更好地理解HPV16-L1 綜合表位提供新的信息，也有助于HPV 疫苗的設(shè)計和臨床應(yīng)用[13]。另外，T 細(xì)胞對 免 疫后HPV16-L1 305-313 位HLA-A2- 和HLA-A24-限制性表位(QIFNKPYWL)的應(yīng)答增加，提示HPV16/18 L1-VLP 疫苗能夠同時誘導(dǎo)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答[17]。

2 L2 相關(guān)表位

L2 蛋白N 末端在不同類型HPV 中高度保守，且其誘導(dǎo)的抗體有交叉中和保護(hù)作用，這使得它在免疫HPV 方面相較于L1 更有優(yōu)勢?；谶@一特性，L2 蛋白N-末端表位或?qū)⒊蔀橄乱淮鶫PV 疫苗研發(fā)的目標(biāo)[18]。L2 蛋白N 末端只有氨基酸17-36的部分暴露于表面，主要用于病毒附著、病毒基因組組裝及誘導(dǎo)低滴度的廣泛交叉中和抗體。氨基酸17-36 處的中和表位被鑒定為RG-1 單克隆抗體的靶標(biāo)，且是決定血清中和活性的主要因素[19]。其N 端存在L2 中和表位的 108-126 區(qū)域，該區(qū)域能通過上皮細(xì)胞表面的膜聯(lián)蛋白A2 異四聚體(A2T)與上皮細(xì)胞結(jié)合并顯示序列保護(hù)。同時，研究人員借助MS2 噬菌體、腺病毒載體等與L2 結(jié)合組裝成新的VLP，這些混合VLP 可以產(chǎn)生L2 高滴度抗體，保護(hù)機(jī)體免受多種類型HPV 感染。

2.1 噬菌體MS2-VLP 疫苗 這是一種基于噬菌體MS2 病毒樣顆粒的混合MS2-L2 候選HPV 疫苗?；旌螹S2-L2 VLP 由兩個MS2-L2 VLP 的混合物組成，包括HPV31 和L2 肽(HPV16)的肽混合物(表位20-31)，以及一個一致的L2 肽(表位69-86)[20]。該疫苗與往常的注射疫苗不同，MS2 噬菌體疫苗加入了兩種黏膜佐劑—霍亂毒素和單磷酸酯A?；魜y毒素是一種黏膜佐劑，與神經(jīng)節(jié)受體結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而激活免疫系統(tǒng)。單磷酸酯A 是一種經(jīng)批準(zhǔn)的疫苗佐劑，它可與B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的TLR4結(jié)合在一起，激活myd88 信號通路，從而激活免疫系統(tǒng)使其可通過口服免疫。研究人員通過實驗證明口服疫苗能保護(hù)小鼠免受HPV11、16、53 和56 的陰道感染和預(yù)防頭頸、口腔的鱗狀細(xì)胞癌[21]。

2.2 PfTrx-8-mer-OVX313 單肽疫苗 這一疫苗使用了氨基酸20-38 表位，這段表位涵蓋了多達(dá)11種HPV 類型，在小鼠和豚鼠上能誘導(dǎo)出26 種黏膜型和皮膚型HPV 中和抗體反應(yīng)。L2 八聚體VLP為合適的靶向結(jié)構(gòu)，八聚體結(jié)合細(xì)菌硫代多辛蛋白(trx)和OVX313 構(gòu)成抗原。抗原PfTrx-8-mer-OVX313 中加入了從嗜熱鏈球菌(pftrx)提取的TRX蛋白，使其具有優(yōu)異的耐熱性[22]。而OV313 來源于補(bǔ)體抑制劑C4 結(jié)合蛋白(C4bp)的一種七重化結(jié)構(gòu)域(Heptamerization)，它大大提高了抗原的免疫原性[23]。PfTrx-8-mer-OVX313 單肽疫苗不僅具有很好的成本效益，而且還克服了很多VLP 疫苗的局限性[24]。

2.3 基于腺病毒的HPV-L2 疫苗 HPV-L2 是已開發(fā)的一種基于罕見的人類腺病毒類型35(HAdV35)載體的候選疫苗，通過蛋白質(zhì)IX(pIX)混合了來自4 種不同HPV 類型的L2 蛋白表位?；旌系膬蓚€異源HAdV35 pIX-L2 顯示載體呈現(xiàn)9 個高度保守的線性表位HPV 類型，每個HAdV35 pIX-L2 都具有良好的可塑性，HAdV35 pIX-L2 載體在不添加佐劑的情況下就可以誘導(dǎo)出有效交叉反應(yīng)性體液免疫[25]?；诔墒斓腁dV 平臺，腺病毒疫苗十分具有潛力，它被證實能對病原體(如艾滋病毒、埃博拉細(xì)菌等)產(chǎn)生強(qiáng)有力的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞反應(yīng)，并具有良好的安全性[26]。HAdV35 pIX-L2 有望成為下一代覆蓋面廣且預(yù)防性良好的HPV 疫苗[27]。

2.4 鞭毛素-L2 疫苗 將Rg1 表位融合到自適應(yīng)鞭毛素-L2 疫苗中，可增強(qiáng)對不同HPV 基因型皮膚攻擊的持久保護(hù)。在沒有外源佐劑的情況下接種Fla-HPV 16 L2 11-200 融合蛋白對HPV 16 具有持久的保護(hù)作用，但對其他類型HPV 的交叉保護(hù)作用有限[28]。若將HPV 6/18/31/39/52 的L2 殘基17-38 加入Fla-HPV 16 L2 11-200 或11-88 中，可通過主動或被動免疫而獲得更廣泛的保護(hù)[29]。

3 E6、E7 相關(guān)表位

3.1 CpG 疫苗 E6、E7 是引起細(xì)胞癌變的關(guān)鍵蛋白，因此針對E6、E7 蛋白開發(fā)治療HPV 相關(guān)腫瘤的免疫治療方法成為理想的目標(biāo)，在E7 蛋白片段中加入佐劑設(shè)計治療性HPV 疫苗已成為當(dāng)前HPV 疫苗研究的新熱點。有研究者將含有CD8+T細(xì)胞表位(E7 49-57)和兩個CD4+T 細(xì)胞表位(E7 49-57 和E7-50-62)的HPV16 E7 43-77 肽作為抗原，并在其中加入CpG 寡核苷酸1826 作為佐劑設(shè)計出一種CpG 疫苗。單一疫苗同時誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞可以更有效地治療HPV，因為CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞在清除HPV 感染細(xì)胞和HPV 轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中起重要作用，而CD4+T 細(xì)胞在啟動CD8+T 細(xì)胞的生成、擴(kuò)展、維護(hù)以及協(xié)調(diào)抗體產(chǎn)生方面發(fā)揮重要作用。CpG 寡核苷酸(odn)是一種具有較強(qiáng)免疫刺激活性的物質(zhì)，它能通過TLR9 信號通路來增強(qiáng)Th1 免疫反應(yīng)，因此常用來作抗腫瘤輔助藥物。將其加入E7 43-77抗原肽中制成疫苗，可以抑制免疫抑制細(xì)胞的表達(dá)如調(diào)節(jié)T 細(xì)胞(Tregs)、骨髓源性抑制細(xì)胞(mdsc)和巨噬細(xì)胞，并有效阻止腫瘤的形成[30]。

3.2 特異性表位肽 作為靶抗原設(shè)計疫苗除了E6E7 蛋白的突變體和CpG 疫苗，使用特異性表位肽作為靶抗原設(shè)計HPV 治療性疫苗也成為免疫領(lǐng)域的研究重點，尤其是具有引發(fā)特異性免疫應(yīng)答能力的T 細(xì)胞表位，它可以避免天然蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的免疫抑制并增強(qiáng)免疫特異性和免疫效應(yīng)[30]。設(shè)計治療性肽疫苗的基本原理：在B 細(xì)胞反應(yīng)不能清除已建立的細(xì)胞內(nèi)病毒癌蛋白情況下，病毒特異性抗體仍可用于抑制病毒蛋白進(jìn)入新細(xì)胞[31]。Wang 等[32]通過預(yù)測人白細(xì)胞抗原(HLA)-A2 限制性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)表位肽，得到6 種來自HPV58 E7 蛋白的肽，為 p1(e77-15：tleyildl)、p2 (e77-15：dheptdl)、p3(e769-77：cstttdv)、p4(e772-80：stttedvrtl)、p5(e779-81：tlqllmgt) 和p6(e788-91：llcttct iv)，所得表位肽可用作制備HPV58 治療性表位。肽疫苗的候選表位肽疫苗因其具有誘導(dǎo)單一特異性免疫應(yīng)答的能力而受到越來越多的關(guān)注。目前，評估HPV 治療性多肽疫苗的研究集中于HPV E6 和E7 蛋白及其CTL 表位。HPV E6 和E7蛋白含有多個CTL 表位，如ctla-4 等對HLA Ⅰ類分子具有高親和力。因此，我們可以鑒定具有強(qiáng)免疫原性和高特異性的表位肽[33]。該過程是制備治療性HPV 多肽疫苗的關(guān)鍵。

4 結(jié)語

本文對近年來HPV L1、L2、E6、E7 等的主要抗原表位的研究結(jié)果進(jìn)行描述。關(guān)于L1 疫苗的研究前期已經(jīng)相當(dāng)充分，近年來對其的研究都集中在可以幫助進(jìn)一步研制疫苗的各類表位工具上。L2 疫苗的中和表位相比L1 疫苗能誘導(dǎo)出更加廣泛的抗體，而像MS2、腺病毒等載體可以賦予L2 疫苗各種特性來彌補(bǔ)自身的局限。E6、E7 的相關(guān)疫苗也有了新的進(jìn)展。未來HPV 疫苗的研究會更加深入，若L2 單肽疫苗、E6E7 表位肽疫苗，CpG疫苗等具備很大潛力的疫苗能夠成功研發(fā)，將會是全球HPV 感染者的福音。