任玲君 方麗娟

[摘要] 目的 觀察隱匿性HBV感染（OBI）S基因突變對HBsAg檢測產(chǎn)生的影響。 方法 挑選9種典型的S基因突變株，從1例OBI患者及3例獻(xiàn)血人員的血清進(jìn)行分離。依次使用突變及野生型S基因重組質(zhì)粒傳染倉鼠的卵巢系統(tǒng)，深入分析入選的突變株HBsAg表達(dá)及突變蛋白對抗體和所用檢測試劑反應(yīng)性的影響。 結(jié)果 利用HBsAg試劑對不同突變株胞內(nèi)HBsAg水平進(jìn)行檢測，與野生株相比，其水平顯著降低。同一種樣品采用抗-His抗體檢測結(jié)果表明，與野生株對比，只有M1、M2、M5、M6、M7的HBsAg-His融合蛋白表達(dá)顯著下降。與野生株比較，不同突變株與6種抗-HBs反應(yīng)性顯著下降，M1、M4、M7、M9和抗體4及M9出現(xiàn)的HBsAg和抗體6反應(yīng)性水平最差。不同突變株和6種HBsAg試劑反應(yīng)性與野生株相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ELISA試劑內(nèi)D、E、F漏檢率依次為11.2%、22.3%、55.7%。 結(jié)論 突變HBsAg和抗-HBs結(jié)合力下降成為引起OBI表現(xiàn)的關(guān)鍵原因之一，通常使用HBsAg試劑對于突變HBsAg檢測能力有一定不足之處，急需進(jìn)行改進(jìn)提升檢測水平。

[關(guān)鍵詞] 隱匿性HBV感染;基因突變;HBsAg檢測;乙肝病毒

[中圖分類號] R512.62? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0020-04

Effect of occult HBV infection related S gene mutation on detection of multiple anti-HBs and HBsAg

REN Lingjun? ?FANG Lijuan

Department of Clinical Laboratory， Hangzhou Dajiangdong Hospital， Hangzhou? ?311225， China

[Abstract] Objective To observe the effect of occult HBV infection （OBI） S gene mutation on HBsAg detection. Methods Nine typical S gene mutants were selected and isolated from the serum of one OBI patient and three blood donors. The ovarian system of the hamster was infected with the mutant and wild-type S gene recombinant plasmid in turn. The expression of the selected mutant HBsAg and the effect of the mutant protein on the reactivity of the antibody and the detection reagent were analyzed. Results The intracellular HBsAg level of different mutants was detected by HBsAg reagent. And the levels were significantly lower than those of wild-type strains. The test results of the same sample using anti-His antibody indicated that compared with that of the wild-type strain， only the expression of HBsAg-His fusion protein of M1， M2， M5， M6 and M7 was significantly decreased. Compared with that of the wild-type strains， the reactivity of different mutants with 6 anti-HBs was significantly decreased， and the reactivity levels of HBsAg in M1、M4、M7、M9 with antibody 4 and HBsAg in M9 with antibody 6 were the worst. The reactivity of different mutant strains with 6 HBsAg reagents was significantly lower than that of wild strains， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The missed detection rates of D， E， and F in the ELISA reagent were 11.2%， 22.3%， and 55.7%， respectively. Conclusion The research shows that the decrease of the binding strength of mutant HBsAg and anti-HBs is one of the key reasons for the performance of OBI. Reagents generally used for the mutant HBsAg have certain shortcomings in detection capability. It is urgent to improve and improve the detection level.

[Key words] Occult HBV infection; Gene mutation; HBsAg detection; Hepatitis B virus

中國作為乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染高發(fā)區(qū)，近些年，因乙肝疫苗接種能有效減少母嬰傳播，人群乙肝表面抗原（HBsAg）攜帶率顯著降低，但一般群體乙肝表面抗原陽性率依然為9.09%，且HBV變異株明顯增多。HBsAg作為用于評估抗HBV治療效果及HBV感染的主要指標(biāo)之一，其主要由226個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，成為刺激B細(xì)胞出現(xiàn)中和性抗體的主要抗原表位。隱匿性HBV感染（OBI）作為乙型肝炎病毒受到感染的特殊形式，也是臨床的一大難題，直接影響HBV診斷結(jié)果，導(dǎo)致臨床漏檢、獻(xiàn)血人員出現(xiàn)篩檢錯(cuò)誤情況時(shí)有發(fā)生，極有可能引起HBV傳播[1]。有學(xué)者研究指出，OBI發(fā)病機(jī)制并不清楚，S基因突變與OBI存在密切的關(guān)系，以現(xiàn)有技術(shù)對血清HBsAg陰性患者進(jìn)行檢測，但血清或者肝組織HBV DNA陽性的HBV感染狀態(tài)[2]。HBV S基因突變?nèi)菀讓?dǎo)致OBI的機(jī)制在于S基因突變使得HBsAg抗原性比改變，容易引起漏診及傳播的情況。本研究挑選9種具有代表性的S基因突變株，深入研究其對于多種抗-HBs及HBsAg檢測試劑反應(yīng)性帶來的影響，以期為類似研究提供一定的指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

入選標(biāo)準(zhǔn)：本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn);均符合《慢性乙型肝炎防治指南》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3];所有入選者均知情本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除資料不全者。在前期研究中，挑選1例OBI和3例OBI獻(xiàn)血者檢查的HBV S基因突變（9種）為對象，均處于MHR區(qū)域，本研究中，首次提到的5種突變基因分別為：aa122-123“KSTGLCK”插入+sQ129N（M5）、sI/T126v+sG145R（M1）、aa126-127“RPCMNCT1”插入突變（M4）、aa115-116“INGTST”插入突變（M2）、aa115-116“INGTST”插入+sG145R（M3）。研究中使用前期構(gòu)成的突變和野生型pcDNA3.1（-）myc-His A重組質(zhì)粒，將其插入HBV S基因區(qū)，用來完成HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)情況。本研究采用前期已經(jīng)成功構(gòu)建的突變型及野生型重組質(zhì)粒，將其插入HBV S基因區(qū)，用于完成HBsAg-His標(biāo)簽融合蛋白。

1.2方法

1.2.1 常用試劑及儀器? 采用德國Qiagen公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒提取試劑盒;ELISA試劑盒主要公司包含珠海麗珠、上?？迫A、北京萬泰等公司;Abbott i2000型全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀;倉鼠卵巢細(xì)胞懸浮表達(dá)系統(tǒng)等。

1.2.2 方法? 利用ExpiCHO懸浮細(xì)胞高表達(dá)系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選取125 mL錐形培養(yǎng)搖床，將其置于溫度為36.5℃、CO2培養(yǎng)箱，速度設(shè)定為（120±5）r/min。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染操作均根據(jù)說明書要求嚴(yán)格執(zhí)行，轉(zhuǎn)染粒子分別是野生、突變型pcDNA3.1（-）/myc-His A-HBs重組質(zhì)粒，進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理后5 d收集細(xì)胞，開展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染5 d后，搜集500 μL細(xì)胞，密度約是8×106/mL，離心操作后棄細(xì)胞上清，添加500 μL×PBS重懸細(xì)胞，通過超聲裂解、離心操作后收集裂解上清。通過雅培Abbott i2000檢測HBsAg水平，每一個(gè)樣品重復(fù)測試3次。利用雙抗體夾心法對抗-HBs和突變HBsAg反應(yīng)性進(jìn)行檢測。將野生型及突變型HBsAg-His融合蛋白稀釋至2.5、0.5、0.1 ng/mL三個(gè)濃度，使用Abbott i2000定量及4種國產(chǎn)定性試劑對HBsAg展開檢測，具體方法及結(jié)果分析根據(jù)說明書要求操作。每一個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立操作最少3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間使用單因素或雙因素方差開展分析，組間使用Dunnett t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胞內(nèi)HBsAg-His蛋白表達(dá)情況

胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)狀況如圖1所示。根據(jù)Abbott i2000定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株對比，9種突變HBsAg-His融合蛋白內(nèi)HBsAg水平顯著降低（P<0.05），以突變株M1、M9及M6下降水平最明顯。同一種樣品檢測結(jié)果可知，M4的HBsAg-His融合蛋白水平顯著比野生株高，與野生株水平相近的分別為M3、M8、M9;與野生株相比，M1、M2、M5、M6、M7表達(dá)水平顯著下降。

2.2 突變HBsAg與不同種類抗-HBs反應(yīng)情況

除了突變株M2、M3出現(xiàn)的HBsAg與抗體3之間的反應(yīng)性無顯著差異，所有突變株所產(chǎn)生HBsAg與6種抗-HBs反應(yīng)性有一定程度的下降;M1、M4、M7及M9與Ab4、M9出現(xiàn)HBsAg與Ab6的反應(yīng)性水平最差，無法被檢測出來，即：S/CO<1。與野生株比較，反應(yīng)性小于50%突變株中，國產(chǎn)Ab5與各突變HBsAg具有較強(qiáng)的反應(yīng)性，見表1。

2.3試劑漏檢率分析

與野生株比較，除M7出現(xiàn)的突變HBsAg和定量及定性試劑A、B，M1、M5出現(xiàn)突變HBsAg和試劑E反應(yīng)性并無太大差異。其他突變HBsAg和6種HBsAg試劑反應(yīng)性均顯著降低。在濃度為0.1 ng/mL條件下，M2、M3、M8和M9突變HBsAg無法被試劑A和B檢測出來。突變抗原處于2.5、0.5及0.1 ng/mL濃度下無法同時(shí)被檢測出來被判定為漏檢，使用ELISA試劑D漏檢率是11.2%，E、F分別為22.3%、55.7%。見圖2。

3 討論

肝臟是人體調(diào)節(jié)血液、新陳代謝的中心，由于受生活環(huán)境不斷惡化及患者自身不健康的生活習(xí)慣所影響，肝臟疾病的發(fā)病率在我國呈現(xiàn)出明顯上升的發(fā)展趨勢。乙型肝炎也可以稱之為乙肝，是由于患者感染乙型肝炎病毒，引起乙型肝炎，這也是一種全世界性的慢性病。我國是慢性乙肝感染的高發(fā)區(qū)，近些年，乙肝患者呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢，具有較高的病死率。乙型肝炎是臨床醫(yī)學(xué)中一項(xiàng)慢性肝臟類疾病，其中，約30%慢性乙肝患者會(huì)演變?yōu)楦斡不痆4]。其主要是由乙肝病毒導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化及肝臟細(xì)胞壞死，隨著患者病情的逐漸加重，肝臟病理學(xué)上表現(xiàn)為假小葉形成和再生結(jié)節(jié)，逐漸演變?yōu)楦斡不瑢颊叩纳钯|(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。HBsAg最早由澳大利亞發(fā)現(xiàn)，也是最早用于診斷HBV的標(biāo)志物。HBsAg清除或消失成為判定HBC治愈的重要指標(biāo)。但也有少部分HBV感染患者存在HBsAg陰性的情況，在血清或肝組織內(nèi)能夠檢測出OBI狀態(tài)，其發(fā)生機(jī)制并未明確[5]。必須注意的是，某些OBI是由于HBV S基因發(fā)生突變引起的，可能的發(fā)生機(jī)制包含降低HBsAg分泌、誘導(dǎo)低親和力抗體干擾等。OBI經(jīng)輸血、血液透析、器官移植等操作引起HBV傳播，且與慢性肝病、HCV感染等因素存在密切的關(guān)系。

如今，臨床上有10%～20%慢性肝病患者根據(jù)臨床表現(xiàn)、常規(guī)的生化檢驗(yàn)、血清學(xué)檢查無法明確病因，肝癌、肝硬化所占比例依次為15%、20%[6-7]。某些血清HBsAg陰性個(gè)體，采用PCR技術(shù)能夠檢測血清及肝組織內(nèi)HBV DNA陽性，被稱作隱匿性HBV感染[8]。這種感染極易出現(xiàn)在抗-HBs或者抗-HBc陽性者，也會(huì)出現(xiàn)在血清HBVM均是陰性的個(gè)體。有學(xué)者研究指出，有部分HBV感染患者HBsAg陰性，在血清或肝組織內(nèi)能夠檢測出HBV DNA，顯示為OBI狀態(tài)，其發(fā)生機(jī)制并未完全清晰，已有研究證實(shí)，其與宿主、病毒相互作用存在密切的關(guān)系[9-10]。必須注意的是，有些OBI是因HBV S基因存在對中和抗體的免疫逃逸突變引發(fā)的，可能發(fā)生的機(jī)制在于降低HBsAg分泌等。

隨著檢測技術(shù)不斷改進(jìn)及發(fā)展，那些經(jīng)典突變抗原可以被主流HBsAg試劑檢測出來，但部分新型突變、聯(lián)合突變抗原依然發(fā)生漏檢的情況，導(dǎo)致輸血、疫苗人群遭受感染[11-12]。HBV S基因突變旨在預(yù)防接種、抗病毒治療等條件下出現(xiàn)的結(jié)果。有學(xué)者研究指出，突變HBsAg極易導(dǎo)致抗體識別表位構(gòu)象發(fā)生改變，促使突變菌株在接種乙肝疫苗的人體中復(fù)制[13-14]。有學(xué)者研究表明，通過隨訪抗HBC治療發(fā)現(xiàn)，S基因相關(guān)疫苗突變株會(huì)隨著時(shí)間不斷穩(wěn)定，并逐步增加，由于免疫壓力出現(xiàn)的OBI相關(guān)突變毒株可逃逸常規(guī)乙肝疫苗有保護(hù)抗體功能，極易導(dǎo)致突變毒株在乙肝疫苗接種者中出現(xiàn)傳播[15-17]。本研究中所選9種HBV S基因突變均處于MHR區(qū)，結(jié)果表明，這些突變株HBsAg水平與野生株比較，均明顯下降。為了解突變株與各種抗-HBs反應(yīng)性下降對其臨床試劑產(chǎn)生的影響，本研究選取不同的試劑盒檢測突變抗原，研究結(jié)果證實(shí)，新型突變M2～M4在內(nèi)大量的突變株和6種HBsAg檢測試劑反應(yīng)性和野生株對比，顯著下降。而使用ELISA試劑D、E、F檢測的漏診率依次為11.2%、22.3%、55.7%。國外也有部分研究證實(shí)，存在HBV S基因突變和HBsAg檢測試劑反應(yīng)性差的情況[18-20]。這也充分說明，設(shè)法改善HBsAg檢測試劑尤為重要。

總之，HBV S基因突變和OBI發(fā)生存在一定的關(guān)系，突變HBsAg與抗-HBs結(jié)合力降低，直接對HBsAg檢測試劑的檢出性能產(chǎn)生影響。攜帶S基因突變的OBI極易發(fā)生漏檢、輸血傳播等情況。因此，下一步開展研究中，擬判斷上述突變株在乙肝疫苗接種群體中與疫苗誘導(dǎo)抗-HBa的反應(yīng)性，并對其傳播風(fēng)險(xiǎn)展開研究。

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（收稿日期：2019-08-09）