許有燊 陳釗 李霞 李健

摘 要：為了篩選可高效降解養(yǎng)殖廢物的菌株，分析其生長特性，從對蝦工廠化養(yǎng)殖水體中分離出1株芽孢桿菌（Bacillus sp. Strain YS-1），研究了環(huán)境因子對其生長的影響。結果表明，芽孢桿菌適宜生長條件為：pH6.5?8.5，溫度25?37℃，鹽度5～15‰，轉速240r/min，葡萄糖濃度0～0.2mg/L，[NH+4]濃度0～2mg/L。最佳培養(yǎng)參數(shù)為：溫度32.9℃，鹽度14‰，pH6.9。擬合多元二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，方程擬合效果良好。

關鍵詞：對蝦工廠化養(yǎng)殖;芽孢桿菌;生長;理化因子;響應面模型

中圖分類號 S917.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）05-0041-07

Screening and Optimization of Culture Conditions of Bacillus sp. Strains

Xu Youshen1，2 et al.

（1Dalian Ocean University， Dalian? 116023， China; 2Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： In order to screen strains that can efficiently degrade aquaculture wastes and analyze their growth characteristics， a strain of Bacillus sp. Strain was isolated from shrimp farmed water， and the effects of environmental factors on its growth were studied. Through single-factor physical and chemical factor experiments， it was found that the optimal growth condition of Bacillus sp. Strain YS-1 is： pH 6.5?8.5， temperature 25?37℃， salinity 5?15‰， speed 240r/min， glucose concentration0～0.2mg/L， NH4+0～2mg/L. The optimal culture parameters of the bacteria were： the temperature 32.9℃， the salinity 14‰，and the pH 6.9.The fitted multivariate quadratic regression model was significant（P<0.05）， and the results of misfit detection were not significant（P>0.05）. The determination coefficient R2 = 0.9492 and the correction coefficient Adj R2=0.8838. The equation fitting effect was better.

Key words： Factory shrimp farming; Bacillus sp.; Growth; Physicochemical factor; Response surface model

水產養(yǎng)殖集約化的快速發(fā)展，提升了養(yǎng)殖經濟效益，但養(yǎng)殖系統(tǒng)中過高的污染物負荷使得養(yǎng)殖水環(huán)境管控面臨巨大挑戰(zhàn)，特別是殘餌糞便、可溶性有機物、氨氮和亞硝酸鹽超標等污染問題。養(yǎng)殖水體污染不僅會影響水產養(yǎng)殖動物的健康與生長，同時養(yǎng)殖廢水直接排放將導致近岸水域的富營養(yǎng)化，破壞周邊的生態(tài)環(huán)境，這嚴重阻礙了水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。據報道，在高密度養(yǎng)殖水體中化學需氧量（Chemical oxygen demand，COD）可達40mg/L以上，氨氮與亞硝酸鹽含量可達10mg/L以上[2-4]。

根據我國《海水養(yǎng)殖排放水要求》規(guī)定養(yǎng)殖廢水排放至少需要達到二級排放水要求，即COD不得超過20mg/L，無機氮含量不得超過1mg/L[5]。為了達到養(yǎng)殖廢水排放標準，養(yǎng)殖水體在排放前必須經過一定凈化處理，微生物處理是其中高效且經濟的一種方法。

關于益生菌對養(yǎng)殖水體中的有機物、氨氮和亞硝酸鹽降解的研究此前多有報道，芽孢桿菌是其中常用的細菌。李永芹等[6]將刺參底泥中分離出來的枯草芽孢桿菌，再應用于養(yǎng)殖水體，其氨氮降解率達到81.9%。孟睿等[7]用芽孢桿菌處理羅非魚養(yǎng)殖廢水，6d后COD和亞硝酸鹽降解率分別為50.32%和99.15%;祁自忠等[8]利用枯草芽孢桿菌處理模擬養(yǎng)殖廢水，48h內COD濃度降解率為55.73%。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中加入芽孢桿菌可以有效去除廢水中的有機物、無機氮等污染物，維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)的平衡。所以篩選出適應對蝦工廠化養(yǎng)殖環(huán)境的芽孢桿菌菌株具有重要意義。

微生物生長有其最適條件，而微生物生長最適條件往往與養(yǎng)殖環(huán)境存在一定沖突。為了縮小養(yǎng)殖環(huán)境與益生菌適宜生長條件間的差距，更好的發(fā)揮益生菌在水環(huán)境調控中的作用，本實驗開展了菌株適宜生長條件的研究，為菌株在水產養(yǎng)殖中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗方法

1.1.1 菌株的分離與篩選 芽孢桿菌分離樣品來自海陽市黃海水產有限公司對蝦工廠化養(yǎng)殖水體，將對蝦工廠化養(yǎng)殖水樣以1∶5的比例接種到富集培養(yǎng)基內，30℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)好的菌懸液置于80℃水浴鍋中加熱20min，篩選芽孢桿菌。將處理過的菌懸液10倍梯度稀釋，吸取不同濃度的稀釋液，涂布于LB營養(yǎng)瓊脂的平板上，30℃培養(yǎng)36～48h。菌落長出后，根據其培養(yǎng)基上外觀形態(tài)特征，挑取單菌落進行純培養(yǎng)，分離純化3代后獲得單一菌株，命名為YS-1菌株。將處于對數(shù)生長期的菌懸液與50%甘油1∶1混合，放入-80℃冰箱保存。

1.1.2 菌株鑒定 將純化后的菌懸液置于90℃水浴鍋中加熱10min，再冰浴10min，以破壞細胞結構，釋放其DNA模板。利用16S rRNA基因通用引物，正向引物為27F，反向引物為1492R建立如下反應體系（20μl）：MIX（10μl）、無菌水（6μl）、上下游引物（各1μl）、模板（1μl）、酶（0.1μl）。PCR擴增程序如下：95℃10min，（95℃變性30s，55℃40s，72℃1min）×35循環(huán)，72℃延伸7min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測。PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司測序，將所獲序列在NCBI中進行Blastn同源序列比較，鑒定菌株。

1.1.3 單因素實驗 從-80℃冰箱中取出保藏的菌種，以1%接種量接種到100mL TSB液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min培養(yǎng)12h以活化菌種。將活化好的菌懸液，用無菌水10倍梯度稀釋，涂布于LB營養(yǎng)瓊脂的平板上，同時做3組重復，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，計數(shù)菌落個數(shù)。細菌培養(yǎng)液光密度值（OD600nm）采用IMARK型酶標儀（日本伯樂）測定，溶液酸堿度采用意大利哈納HANNA HI98103型筆式酸度計完成，接種實驗在超凈工作臺內完成。

選取溫度、鹽度、pH、轉速、碳源和氮源6個環(huán)境因子做單因素實驗，每個因子設計5個梯度，每個梯度設置3個重復。將活化后菌懸液，以1%接種量接種到100mL培養(yǎng)基中。單因素實驗中，控制其余條件與菌種活化條件相同。其中溫度、鹽度、轉速、pH單因素實驗使用TSB培養(yǎng)基，碳源和氮源單因素實驗使用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基?；A發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、pH7.0～7.5。葡萄糖、蛋白胨、NH4CL、NaCl、MgSO4·7H2O和其他化學試劑皆為分析純，其中蛋白胨為北京奧博星生物技術有限責任公司產品，余者皆購自于國藥集團化學試劑有限公司。富集培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），由北京陸橋技術有限公司生產。LB營養(yǎng)瓊脂由青島高科園海博生物技術有限公司生產。

pH：采用1mol/L的NaOH和HCL調節(jié)TSB培養(yǎng)液的酸堿度，設置5.5、6.5、7.5、8.5、9.5共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;溫度：設置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃共5個梯度，接種后，120r/min轉速下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;鹽度：向TSB培養(yǎng)基中添加NaCl調整鹽度為5、15、25、35、45共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;轉速：設置80r/min、120r/min、160r/min、200r/min、240r/min共5個梯度，接種后，30℃下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;碳源：采用10mg/L的葡萄糖溶液配制基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，設置葡萄糖梯度0、0.01、0.1、0.2、0.5mg/L，接種后，37℃、160r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;氮源：以氨氮替換培養(yǎng)基中蛋白胨，采用10mg/L的NH4Cl溶液配制基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，設置氨氮梯度0、0.5、1、2、5mg/L接種后，37℃、160r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度。

1.1.4 響應面分析 選擇在實際生產中影響較大的溫度、鹽度、pH 3個因素，依據RSM中Box Behnken中心組合原則，采用Design Expert10.0軟件進行分析。然后選用分析所得的最佳生長復合參數(shù)培養(yǎng)，并測定培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液的OD600值（n=3）以證實該方法的可靠性。

1.2 數(shù)據處理 采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法判斷單因素不同濃度處理組之間的差異，統(tǒng)計分析通過Excel 2016和SPSS 20.0統(tǒng)計軟件實現(xiàn)，差異顯著水平為P<0.05。實驗采用Design Expert 10.0軟件進行數(shù)據處理，對溫度、鹽度和pH與芽孢桿菌生長響應值進行二次方程回歸擬合，建立數(shù)學模型，用決定系數(shù)和回歸方程的校正系數(shù)來判斷數(shù)學模型的擬合程度，多變量方差分析決定方程的意義[9]。優(yōu)化得到的實驗條件重復3次，以驗證模型的準確性。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離與篩選 樣品接種于芽孢桿菌富集培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加熱處理后經分離、純化得到菌株。將菌株擴增培養(yǎng)后，涂在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。該菌株單菌落呈灰白色、外形不規(guī)則、菌落邊緣不整齊、表面皺褶較粗糙。

以該菌株DNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，獲得大小約1500bp的16S rRNA基因。經Blastn同源序列比較，表明YS-1菌株（MN841924）與Bacillus sp.相似度較高，且與登陸號為MH518191的Bacillus sp.菌株親緣關系最近。MH518191，MK578252，KY621529與該菌株的16S rRNA基因的序列同源性超過99%，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，在細菌系統(tǒng)發(fā)育分類學上，可初步將該菌株歸屬芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

2.2 單因素實驗

2.1.1 pH對芽孢桿菌生長的影響 由圖2可知，YS-1菌株在pH為6.5～8.5范圍內生長良好，4h后開始顯著生長，進入對數(shù)生長期，7h后菌株生長進入穩(wěn)定期，其中pH為7.5的實驗組菌株生長最佳，5h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h后OD600值穩(wěn)定在0.8～0.85范圍內。pH為6.5和8.5的實驗組菌株也可生長，8h后OD600值穩(wěn)定在0.69～0.73范圍內。pH為5.5和9.5的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，強酸、強堿條件下菌株無法生長。

2.1.2 溫度（T）對芽孢桿菌生長的影響 由圖3可知，YS-1菌株在溫度為30℃～37℃范圍內生長良好，2h后開始顯著生長，進入對數(shù)生長期，7h后菌株生長進入穩(wěn)定期，其中溫度為37℃的實驗組菌株生長最佳，2h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h OD600值達到峰值0.89，8～12h內37℃組菌體的OD600值逐漸下降，到12h降至0.82。溫度為30℃的實驗組菌株，2h后開始顯著生長，進入對數(shù)生長期，8h后OD600值穩(wěn)定在0.84～0.86范圍內。溫度為25℃的實驗組菌株，4h后開始顯著生長，進入對數(shù)生長期，11h后OD600值穩(wěn)定在0.91～0.93范圍內。溫度為15℃和20℃的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，低溫條件下菌株無法生長。

2.1.3 鹽度（S）對芽孢桿菌生長的影響 由圖4可知，芽孢桿菌對鹽度的適應范圍很廣，在0～45‰的鹽度范圍內均可生長，各組從3h開始逐步進入對數(shù)增長期。且鹽度越低菌體的生長速度越快，5h各組之間出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），鹽度較高時，芽孢桿菌的生長速度受到抑制;8h時5‰組生長速度最快且達到最大值，菌體的OD600值約為0.84;12h時5‰和15‰組菌體的OD600值均可達到0.85，與其余各組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.1.4 轉速對芽孢桿菌生長的影響 由圖5可知，芽孢桿菌的生長速度與轉速成正相關，即轉速越快芽孢桿菌的生長速度越快。各實驗組從5h開始，逐步進入對數(shù)增長期;7h后各實驗組之間產生顯著性差異（P<0.05），且轉速越快菌體生長速度越快，240r/min下生長速度最快菌體的7h OD600值達到0.9;至12h各組之間差異極顯著（P<0.01），轉速為240r/min時菌株生長速度最快，12h菌株的OD600約為1.30。

2.1.5 碳源對芽孢桿菌生長的影響 由圖6可知，YS-1菌株在葡萄糖濃度為0～0.2mg/L范圍內生長良好，12h持續(xù)增長，12h后OD600值穩(wěn)定在0.65～0.68范圍內，各實驗組之間不存在顯著差異（P>0.05）。葡萄糖濃度為0.5mg/L的實驗組菌株前期生長迅速，2h菌體的OD600值顯著高于其它各組（P<0.05），但之后生長速度逐漸減慢，3～7h與其余各組之間差異不顯著（P>0.05），8h后菌體的OD600值顯著低于其它各組（P<0.05），OD600值穩(wěn)定在0.40～0.43范圍內。當葡萄糖濃度過高時，會對芽孢桿菌的生長起到抑制作用。

2.1.6 氨氮對芽孢桿菌生長的影響 由圖7可知，YS-1菌株在NH4+濃度為0～2mg/L范圍內可以生長，12h持續(xù)增長，12h后OD600值穩(wěn)定在0.12～0.13范圍內，各實驗組之間不存在顯著差異（P>0.05）。NH4+濃度為5mg/L的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，與其余各組存在顯著性差異（P<0.05），高濃度NH4+條件下菌株無法生長。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析實驗結果 根據單因素影響實驗結果，我們選擇合適的參數(shù)范圍進行3因素3水平響應面設計與實驗，其與結果見表1。利用Design expert 10.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據進行多元回歸擬合，得到芽孢桿菌培養(yǎng)8h后的OD600值與x（溫度）、x1（鹽度）、x2（pH）之間的二元回歸方程為：

OD600=1.08-4.900E-003x+0.0496x1-0.064x2+5.550E-003xx1+0.0735xx2-0.0411x1x2-0.13x2-0.046x12-0.089x22

對該模型進行方差分析見表2，結果表明，基于OD600值所建立的回歸模型是顯著的（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），通過失擬檢測，擬合方程有效。決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，擬合方程滿足有效要求。

表3為回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果。由表3可以看出，鹽度和pH的一次效應對芽孢桿菌的生長影響達到極顯著水平（P<0.01），但溫度的一次效應對其生長影響不顯著（P>0.05）;溫度、鹽度和pH的二次效應對芽孢桿菌的生長影響都達到顯著水平（P<0.05）;溫度和pH之間的交互作用對特定生長率的影響達到極顯著水平（P<0.01）。

2.2.2 菌體生長條件的優(yōu)化 利用Design-Expert軟件對表1的數(shù)據進行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖8。等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示2個因素交互作用不顯著，橢圓形表示2個因素交互作用顯著[12]。從圖8可以直觀看出，溫度和鹽度、溫度和pH以及鹽度和pH對芽孢桿菌生長的交互作用顯著。且x、x1、x2都存在極值點，利用Design-Expert軟件對代表菌體濃度的OD600值的二次多項式數(shù)學模型解逆矩陣得知，3個因素的最優(yōu)試驗點（x、x1、x2）代碼值（6.88、14.06、32.87），此時Y取最大值1.12。以響應面分析得到的芽孢桿菌最佳生長條件，做3次平行試驗，驗證試驗結果。試驗結果為1.18與預測相符，響應面分析方法可靠。

3 討論與結論

對蝦工廠化養(yǎng)殖具有更高的養(yǎng)殖密度，與傳統(tǒng)粗放養(yǎng)殖相比可以提高養(yǎng)殖效率、獲取更多的經濟利益，但這必然伴隨著高餌料投喂和嚴重的水體污染[10-12]。養(yǎng)殖水環(huán)境迅速惡化，產生的有機污染物和無機氮，對養(yǎng)殖生物有毒害作用。目前，使用微生態(tài)制劑已成為水產養(yǎng)殖中調節(jié)養(yǎng)殖水環(huán)境的重要手段，不但可以控制病害發(fā)生，還可以減少污染物的排放[13]。但隨著微生態(tài)制劑使用規(guī)模不斷擴大，微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖環(huán)境缺少針對性的問題也逐步暴露出來，所以本研究以對蝦工廠化養(yǎng)殖水體為樣品來源，篩選出1株可適用于對蝦工廠化養(yǎng)殖的芽孢桿菌YS-1，并根據16sRNA基因測序，將該菌鑒定為芽孢桿菌。

生物學特性研究表明，源自對蝦工廠化養(yǎng)殖池的芽孢桿菌 YS-1同時對多種理化因子具有廣泛的適應性，可見該菌株具有較強的環(huán)境適應能力，可用于擴大培養(yǎng)與廣泛應用。由于菌株YS-1是工廠化對蝦養(yǎng)殖的原生細菌，當作為微生態(tài)制劑應用于工廠化環(huán)境時，較其它來源的益生菌具有更強的適應能力、可以更有效改善水質。因此，芽孢桿菌YS-1的分離、篩選為對蝦工廠化養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境提供了優(yōu)質的原生菌種，對維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)平衡具有重大意義。

根據單因素實驗結果可以看出，芽孢桿菌生長適應性較強。YS-1菌株在pH為6.5～8.5均可生長，但綜合多因素條件時，在弱堿條件下生長受抑制，更適宜在弱酸條件下生長。這與之前的研究結果相吻合，已有研究報告表明[14-16]枯草芽孢桿菌在pH 7～9范圍內生長較好，但也有學者表示[17]枯草芽孢桿菌更適宜在弱酸性條件下培養(yǎng)。YS-1菌株在溫度25?37℃間的范圍條件下都能生長，且溫度越高生長速度越快，但溫度達到37℃時，OD600呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明菌株在這種溫度下會迅速進入衰亡期。這與之前的研究結果相似，趙達[18]等研究表明35℃為枯草芽孢桿菌的最適生長溫度。YS-1菌株在5～45‰的鹽度范圍內均可生長，在5～15‰的低鹽度條件下生長較快。YS-1菌株在轉速為120～240r/min均可生長，且轉速越快生長速度越快，芽孢桿菌作為好氧微生物，高轉速提供的高溶氧有利于其生長。這與之前的研究結果不同，趙達等[18]研究表明搖床轉速為180r/min時最適宜芽孢桿菌的生長，隨著轉速的繼續(xù)增加芽孢桿菌的生長受到抑制。

YS-1菌株在葡萄糖濃度0～0.2mg/L范圍內可以生長，12h菌體的OD600約為0.65，當濃度達到0.5mg/L時芽孢桿菌生長受到抑制，12h菌體的OD600約為0.40。這與之前的研究結果不同，高磊等[19]研究表明表明高C/N更有助于異養(yǎng)微生物的生長，所以在養(yǎng)殖過程中加入蔗糖，提高碳氮比。本實驗與其結果不同原因可能是培養(yǎng)基條件簡單，葡萄糖濃度影響溶液滲透壓抑制了芽孢桿菌的生長。YS-1菌株在NH4+濃度0～2mg/L范圍內時，芽孢桿菌可以生長，當NH4+濃度達到5mg/L時，芽孢桿菌無法生長，說明當氨氮作為唯一氮源時，高濃度氨氮對芽孢桿菌有抑制作用。具有脂溶性的分子氨易透過膜結構進入細胞內，引起細胞死亡[20-21]，所以高濃度的NH4+濃度對芽孢桿菌有抑制作用。

溫度、鹽度、pH、轉速及營養(yǎng)物質等多種理化因子對芽孢桿菌的生長都具有不同程度的影響，對其進行系統(tǒng)研究有助于深入了解芽孢桿菌在對蝦工廠化養(yǎng)殖微生態(tài)系統(tǒng)中的生存生長條件。自20世紀70年代，科學界逐漸重視溫度、鹽度和pH這3種因子的作用[22-23]。郝林華等[24]采用單因素分析法研究了溫度、pH和多種營養(yǎng)物質對芽孢桿菌生長的影響。而本研究不但分析了這6種因子的單因素作用效果，還選擇3種在實際養(yǎng)殖中起決定性作用的因素，采用響應面分析法建立了多因素復合作用下芽孢桿菌的生長模型，獲得了該菌的最佳培養(yǎng)參數(shù)。已有研究表明，使用響應面分析法優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件，可以有效提高目的產物的產量。李志華[25]使用響應面分析法對谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，有效提高了谷氨酸產量;黃麗金等[26]采用響應面分析法對德氏乳桿菌的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，產出菌液濃度提高了5倍。本實驗結果表明，芽孢桿菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH 6.88、溫度32.87℃和鹽度14.06‰;此外，二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），方程通過失擬檢測，表明擬合方程有效。決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，說明本實驗所建響應面分析是可靠的。響應面分析法可以減少實驗次數(shù)，同時考慮多因素之間的交互作用，擬合多元二次函數(shù)，直接反映因子與響應值之間的關系[27]。因此，新方法更直觀的預測對蝦工廠化養(yǎng)殖中環(huán)境因子的改變對芽孢桿菌生長動力學的影響。

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（責編：張 麗）