馬思思 辛建攀 田如男

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

銅離子(Cu2+)是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素之一[1]，廣泛分布在植物細胞內多種酶的活性中心，參與光合作用、呼吸作用、碳水化合物代謝、氮代謝、細胞壁合成和激素信號傳遞等多項生理生化代謝過程[2]。Cu2+在光合電子傳遞過程中承擔著重要作用[3]，PSI的電子先傳遞給質體藍素(銅蛋白)，通過Cu2+化合價的變化，再將電子傳遞到PSII[4]。研究表明，低質量濃度Cu2+可提高植物葉片葉綠素、類胡蘿卜素質量分數(shù)及PSII的綜合活性，進而提高光能轉化效率和光合速率，促進植物生長[5]。但是，由于多數(shù)植物體內金屬平衡網絡缺乏應對高質量濃度重金屬離子的能力，植物會遭遇高質量濃度重金屬離子的毒害作用[6]，當生長介質中Cu2+質量濃度超過一定范圍時，植物細胞中會積累過量的過氧化氫、羥基自由基、單線態(tài)氧等活性氧自由基，對光合系統(tǒng)(如葉綠體結構、D1蛋白質)造成一定的破壞作用，從而不利于葉片光合代謝過程[7]。

梭魚草(Pontederiacordata)為雨久花科(Pontederiaceae)梭魚草屬(Pontederia)多年生大型挺水植物，植株高大，頂生穗狀花序，小花藍紫色，園林觀賞價值較高，是濕地重建和恢復、城市景觀水體綠化的良好材料[8]；其根系發(fā)達，生物量大，在重金屬污染環(huán)境修復中具有較大潛力，以往有學者對梭魚草去除重金屬銅的效率進行比較分析，發(fā)現(xiàn)當初始Cu溶解態(tài)質量濃度為1.804 mg·L-1時，修復30d后，梭魚草對Cu2+質量濃度的去除率為58%，表明梭魚草對Cu2+具有一定的富集能力[9]。植物光合作用是植物各種代謝活動中對環(huán)境因子最敏感的生理過程之一，可以用來判斷植物對重金屬污染環(huán)境的適應能力[10]。陸奇杰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+質量濃度的增加會使植物葉片葉綠素質量分數(shù)和Pn、Gs下降速度急劇加快。張文斌等[12]研究了不同Cu2+質量濃度下水葫蘆葉片初始熒光、光化學淬滅系數(shù)和光合電子傳遞量子效率顯著下降?？梢?，重金屬脅迫會對植物光合系統(tǒng)產生嚴重的影響。本研究采用液培法，研究了不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片光合色素質量分數(shù)、光合生理學參數(shù)及葉綠素熒光參數(shù)的影響，以探究梭魚草葉片光合機構對Cu2+的適應能力，為梭魚草在Cu2+污染水體生態(tài)修復中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

試驗于南京林業(yè)大學國家級園林實驗示范教學中心溫室進行。供試的梭魚草采購于杭州市天景水生植物園。于2018年4月份，在池塘水中培養(yǎng)，待植株高40～50 cm時，選取長勢一致，生長狀況良好的植株，置于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中適應性培養(yǎng)20 d后用于試驗。

試驗采用水培的方法，培養(yǎng)液采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液配制重金屬處理液，試劑以分析純CuSO4·5H2O配制，Cu2+質量濃度梯度設置為0、5、10、20 mg·L-1(以純Cu2+計算)，分別為GB 3838—2002國家地表水環(huán)境質量標準中V類水的0、5、10、20倍，處理組分別以T1、T2、T3表示，對照組用CK表示。處理時，每個小桶加入2 L重金屬處理液，每桶1株植物，試驗期間定期補充蒸餾水至初始體積。每個處理10株，重復3次。

1.2 測定方法

1.2.1 葉片光合色素質量分數(shù)測定

參考李合生[13]的方法，并略加修改，用去離子水將葉片清洗干凈，用濾紙吸干，去除主脈，剪碎混勻，稱取0.2 g，共3份，置于20 mL的試管中，加入15 mL 95%乙醇，避光浸泡24 h，至組織變白無綠色，期間振蕩試管使萃取液顏色均勻。以95%乙醇為空白對照，在波長665、649、470 nm下測定提取液吸光值。

1.2.2 光合氣體交換參數(shù)的測定

銅處理5 d后，于晴朗無云的09:00—11:30選取植株上部功能葉片，采用英國PP-Systems便攜式光合測定儀(CIRAS-2)測定各氣體交換參數(shù)，包括葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(E)、氣孔導度(Gs)、飽間CO2摩爾分數(shù)(Ci)、葉面飽和蒸氣壓虧缺(VP，D)等。氣孔限制值(Ls)按照吳克寧等[14]的計算方法：Ls=1-Ci/Cr(Cr為大氣CO2質量濃度)，水分利用效率(WU，E)按照張正斌[15]的計算方法：WU，E=Pn/E。測定控制光合有效輻射參數(shù)(PA，R)為1 000 μmol·m-2·s-1，葉室溫度25 ℃，CO2摩爾分數(shù)為380～420 μmol·mol-1。

1.2.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定

銅處理5 d后，于晴朗無云的09:00—11:30，選取與測定氣體交換參數(shù)相同的功能葉片測定葉綠素熒光參數(shù)。測定前先將葉片暗適應20 min，然后利用連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Handy PEA)測定各處理梭魚草葉片葉綠素熒光參數(shù)，包括暗適應狀態(tài)的最大熒光(Fm)、可變熒光產量(Fv)、潛在光合活性(Fv/Fo)、PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、光合性能指數(shù)(PI，a，b，s)、反應中心凈關閉速率(dV，G/dt，o和dV/dt，o)、單位面積吸收的光能(AB，S/CS，o)、單位面積捕獲的光能(TR，o/CS，o)、單位面積電子傳遞的量子產額(ET，o/CS，o)、單位面積的熱耗散(DI，o/CS，o)等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Duncan新復極差法檢驗差異顯著性(P<0.05，P<0.01)。采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片光合色素質量分數(shù)的影響

由表1可知，5 mg·L-1Cu2+處理下，梭魚草葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總質量分數(shù)與CK無明顯差異，表明梭魚草葉片葉綠素對較低質量濃度Cu2+具有較強的耐受性。隨溶液中Cu2+質量濃度的繼續(xù)增加，梭魚草葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總質量分數(shù)呈下降趨勢，其質量分數(shù)比CK分別下降了17.43%～43.65%、19.85%～42.14%和31.30%～43.24%。在5～20 mg·L-1Cu2+處理下，梭魚草葉片類胡蘿卜素質量分數(shù)呈先上升后下降趨勢。當溶液中Cu2+質量濃度為5 mg·L-1時，葉片類胡蘿卜素質量分數(shù)比CK增加了13.2%，這有利于保護葉綠素免遭活性氧自由基的破壞；當溶液中Cu2+質量濃度為10、20 mg·L-1時，葉片類胡蘿卜素質量分數(shù)比CK分別下降了17.03%、31.30%。

表1 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片光合色素質量分數(shù)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤差；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片氣體交換參數(shù)的影響

如表2所示，隨溶液中質量濃度Cu2+的增加，梭魚草葉片Pn、E、Gs和WU，E均呈下降趨勢。經不同質量濃度Cu2+處理5 d時，梭魚草葉片Pn、E、Gs比CK分別降低了43.77%～63.56%、61.85%～77.12%和70.07%～85.29%，而葉片Ci、Ls無明顯變化，表明非氣孔因素是Cu2+處理下梭魚草葉片Pn下降的主要原因。與CK相比，經5～20 mg·L-1Cu2+處理5 d時，梭魚草葉片WU，E降低了40.00%～52.31%，葉片蒸氣壓虧缺(VP，D)則表現(xiàn)出相反的變化趨勢，表明Cu2+質量濃度對梭魚草葉片水分代謝活動產生了不利影響。

表2 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片氣體交換參數(shù)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤差；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.3.1對梭魚草葉綠素熒光參數(shù)Fm、Fv和Fv/Fo的影響

Fm為暗適應下的最大熒光強度，反映通過光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的電子傳遞情況。Fv為最大可變熒光強度，表征參與PSⅡ光化學反應的光能輻射部分，反映了PSⅡ原初電子受體QA的還原情況。隨著溶液中Cu2+質量濃度的增加，梭魚草葉片F(xiàn)m、Fv均呈下降趨勢(表3)。與CK相比，經5、10 mg·L-1Cu2+處理5 d，葉片F(xiàn)m、Fv無明顯變化；25 mg·L-1Cu2+處理導致Fm下降48.30%，表明高質量濃度Cu2+導致梭魚草葉片PSⅡ反應中心電子傳遞受阻。同時，當溶液中Cu2+質量濃度最高時，梭魚草葉片F(xiàn)v、Fv/Fo(PSⅡ潛在光合活性)比CK分別下降了59.93%、61.62%，表明高質量濃度Cu2+降低了梭魚草葉片PSⅡ潛在光合活性，導致光合機構光能利用率下降[16]。

2.3.2對梭魚草葉片PI，a，b，s和Fv/Fm的影響

PI，a，b，s是以吸收光能為基礎的性能指數(shù)，可以反映植物葉片PSⅡ的功能和結構的總體狀況。隨溶液中Cu2+質量濃度的增加，梭魚草葉片PI，a，b，s總體呈下降趨勢(表3)。與CK相比，經5～25 mg·L-1Cu2+處理5 d時，葉片PI，a，b，s降低了51.16%～87.44%，表明Cu2+破壞了梭魚草葉片PSⅡ反應中心的功能和結構。Fv/Fm為PSⅡ反應中心最大光化學量子產量，是反映PSⅡ原初光能轉化效率的重要指標。梭魚草植株在25 mg·L-1Cu2+處理下，葉片F(xiàn)v/Fm比CK降低了24.39%，表明較高質量濃度Cu2+會導致梭魚草葉片光合作用產生光抑制，從而降低光合機構的光能轉化效率。

表3 不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤差；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 對梭魚草葉片反應中心關閉凈速率的影響

dV，G/dt，o和dV/dt，o能夠反映植物葉片PSII反應中心關閉的凈速率。如表3所示，不同質量濃度銅處理下梭魚草葉片反應中心凈關閉速率(dV，G/dt，o和dV/dt，o)呈升高趨勢。與CK相比，在5 mg·L-1和10 mg·L-1處理下葉片dV，G/dt，o和dV/dt，o無顯著變化，在25 mg·L-1處理下葉片dV，G/dt，o和dV/dt，o與CK相比差異極顯著，分別是對照的2.46倍和1.11倍，表明較高質量濃度的Cu2+處理導致梭魚草葉片單位時間光反應中心的關閉速度顯著減慢，說明高質量濃度Cu2+處理下電子傳遞的速率減慢。

2.3.4 對梭魚草葉片比活性及表觀能量流參數(shù)的影響

隨溶液中Cu2+質量濃度的增加，梭魚草葉片單位反應中心吸收的光能(AB，S/RC)、單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量(TR，o/RC)和單位反應中心消耗的能量(DI，o/RC)呈增加趨勢，而單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ET，o/RC)無顯著變化(表4)。與CK相比，在25 mg·L-1Cu2+處理下，葉片AB，S/RC增加了91.02%；5、10 mg·L-1Cu2+處理下，葉片TR，o/RC分別增加了24.29%、40.95%；25 mg·L-1Cu2+處理5 d時，葉片DI，o/RC升高至CK的4.20倍。上述分析表明，在較高質量濃度Cu2+處理下，梭魚草葉片捕獲電子的能力及捕光天線面積增加，并以熱耗散的形式來減緩過量Cu2+對PSⅡ反應中心的破壞。

如表5所示，各處理組中梭魚草葉片AB，S/CS，o、TR，o/CS，o與CK相比無明顯變化。在最高質量濃度Cu2+處理下，葉片ET，o/CS，o比CK降低了55.27%，且達到極顯著水平，表明單位激發(fā)態(tài)面積的葉片光合能力下降。隨溶液中Cu2+質量濃度的增加，葉片DI，o/CS，o呈上升趨勢；當溶液中Cu2+質量濃度為25 mg·L-1時，葉片DI，o/CS，o為CK的2.29倍，這有利于減緩過剩激發(fā)能對PSⅡ反應中心的破壞。

表4不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片比活性參數(shù)的影響

處理AB,S/RCTR,o/RCET,o/RCDI,o/RCCK(2.56±0.11)Bb (2.10±0.07)Bb (1.11±0.01)Aa(0.46±0.04)AbT1(3.42±0.41)ABab(2.53±0.15)ABab(1.18±0.01)Aa(0.88±0.26)AabT2(3.64±0.51)ABab(2.61±0.17)ABa(1.26±0.06)Aa(1.03±0.33)AabT3(4.89±0.68)Aa(2.96±0.13)Aa(0.77±0.38)Aa(1.93±0.55)Aa

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤差；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

葉綠素的質量分數(shù)可以反映植物利用光能和適應外界環(huán)境的能力。研究表明，重金屬脅迫會抑制植物光合色素的生物合成，破壞PSII反應中心電子傳遞，不利于光合作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，較高質量濃度Cu2+處理下梭魚草葉片出現(xiàn)明顯的褪綠現(xiàn)象，與葉片光合色素質量分數(shù)的下降密切相關。產生這一結果的原因可能是，過量Cu2+使葉綠素酶活性增加，葉綠素分解速率加快[17]；Cu2+與葉綠素中的蛋白質巰基結合或取代其中的Fe2+、Mg2+、Zn2+，改變葉綠素蛋白結構[17]。類胡蘿卜素是一類非酶促活性氧淬滅劑，能夠中斷鏈活性氧的反應[18]，5 mg·L-1的Cu2+處理下類胡蘿卜素質量分數(shù)顯著增加，這可能與葉片通過積累類胡蘿卜素清除單線態(tài)氧(1O2)等活性氧，使葉片免受活性氧傷害有關[19]。

表5不同質量濃度Cu2+對梭魚草葉片表觀能量流參數(shù)的影響

處理AB,S/CS,oTR,o/CS,oDI,o/CS,oET,o/CS,oCK(560.78±19.30)Aa(460.89±12.43)Aa(99.88±7.89)Ab (243.11±7.73)Aa T1(609.33±22.06)Aa(464.15±34.64)Aa(145.18±17.16)Aab(219.90±22.83)ABaT2(606.89±44.28)Aa(454.13±52.00)Aa(152.76±7.72)Aab(224.96±28.66)ABaT3(593.75±100.25)Aa(370.41±25.42)Aa(228.43±74.84)Aa(108.74±41.30)Bb

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤差；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

在逆境條件下，植物光合速率下降的原因包括氣孔因素和非氣孔限制因素。Farquhar et al.[20]認為，若隨葉片Gs的下降，氣孔限制值(Ls)下降，則說明Pn下降的原因為氣孔因素；若隨氣孔導度(Gs)的下降，Ci不變或升高，則說明Pn下降為非氣孔限制因素，即葉肉細胞光合活性下降，如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶活性的降低[21]。本試驗中，隨溶液中Cu2+質量濃度的增加，梭魚草葉片Ci無明顯變化，Gs與Pn均呈下降趨勢，這與其他學者在水稻(Oryzasativa)[22]上的研究結果相一致，表明隨Cu2+質量濃度增加，梭魚草葉片Pn的下降主要是由受非氣孔因素引起的。葉片水分利用效率(WU，E)能夠表征植物對自身蒸騰耗水量的利用能力，是決定植物在逆境中能否正常生長的重要因素[23]。本研究中，Cu2+質量濃度≥10 mg·L-1時，梭魚草葉片WU，E比對照組下降了43.85%～52.31%，表明Cu2+破壞了梭魚草植株對水分的吸收和利用，試驗期間觀察的梭魚草葉片干枯、卷曲支持了這一觀點。氣孔是外界水分和氣體進入植物葉肉細胞的重要門戶，能夠直接感知葉片VP，D的變化，并隨葉片VP，D增加呈下降趨勢[24]。本研究中，梭魚草葉片VP，D與Gs具有明顯的負相關關系(y=-19.495x+822.11，R2=0.900 5)，表明Cu2+處理導致葉片VP，D的增加誘使氣孔導度下降，從而妨礙蒸騰作用，導致葉片水分代謝失衡。

在環(huán)境脅迫條件下，合理調整和分配PSⅡ反應中心的能量是提高植物光合適應性的重要途徑之一。植物葉片PSⅡ反應中心吸收的光能(AB，S/RC、AB，S/CS，o)主要用于電子傳遞(ET，o/RC、ET，o/CS，o)、能量耗散(DI，o/RC、DI，o/CS，o)和質體醌還原(TR，o/RC)等[30，34]。本研究中，在最高質量濃度Cu2+處理下，梭魚草葉片AB，S/RC、TR，o/RC顯著高于對照組，這是由于單位面積的反應中心數(shù)目減少及剩余有效反應中心效率增強，以更好的耗散電子傳遞鏈中的能量[35]。表明葉片天線色素吸收和捕獲的光能大部分以熱量形式耗散，導致DI，o/RC升高，這可能有利于維持梭魚草葉片光能吸收與利用能量之間的平衡[36]。但也有學者認為脅迫下反應中心密度下降，導致單個反應中心接受的光能負擔急劇增加，使得AB，S/RC、TR，o/RC、DI，o/RC增大，這種現(xiàn)象會加速脅迫對有活性反應中心的破壞[37]。因此，對脅迫下植物光合機構的能量傳遞、利用過程需要更進一步的研究。高質量濃度Cu2+還會導致梭魚草反應中心光能利用率下降，表現(xiàn)為電子傳遞能量(ET，o/CS，o)的下降和熱耗散能量(DI，o/RC和DI，o/CS，o)的增加，與重金屬脅迫下浮萍(Lemnagibba)[38]葉片光合反應中心能量分配的變化相一致，表明過剩的激發(fā)能主要以熱耗散的形式淬滅，這可能是較高質量濃度Cu2+處理下梭魚草葉片光合機構進行自我保護的機制之一，有利于減緩過剩激發(fā)能損傷葉綠體類囊體膜和光系統(tǒng)ⅡD1蛋白周轉[27]。

綜上所述，梭魚草對低質量濃度(5 mg·L-1)Cu2+綜合表現(xiàn)出較好的光合適應能力，能夠維持相對穩(wěn)定的光合色素質量分數(shù)和光合生理活性，這很可能與類胡蘿卜素質量分數(shù)的增加有關。隨Cu2+質量濃度升高，非氣孔因素是導致梭魚草葉片Pn下降的主要原因。同時，較高質量濃度Cu2+會降低梭魚草葉片PSII反應中心活性，但其可通過關閉部分反應中心、增加熱耗散等途徑減緩Cu2+對光合機構的破壞。