羅佳憲，鄒 瓊，朱惠蓮，楊 博，王永華,4

(1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006； 2.廣東粵膳特醫(yī)營養(yǎng)科技有限公司，廣東 佛山 528000；3.中山大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510080； 4.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641)

《中國心血管病報(bào)告2018》指出，我國現(xiàn)有心血管疾病患者約2.9億，心血管病是導(dǎo)致死亡的最主要原因[1]，而高脂血癥是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因之一,是動(dòng)脈粥樣硬化最主要的危險(xiǎn)因素[2]。研究顯示，通過對(duì)高脂血癥，特別是高膽固醇血癥的預(yù)防和治療，可以明顯降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[3]。臨床治療上采用西藥的療效比較顯著，但長時(shí)間使用存在一定副作用，會(huì)給機(jī)體帶來不良反應(yīng)。如何有效地通過飲食干預(yù)降低高膽固醇血癥的發(fā)病率是當(dāng)代人們研究的熱點(diǎn)。

甘油二酯(DAG)作為一種功能性脂質(zhì)，從2000年以來就被廣泛地研究。DAG是由兩分子脂肪酸與甘油酯化得到的產(chǎn)物，屬于油脂的天然成分[4]。DAG有1,3-DAG和1,2-DAG兩種異構(gòu)體，在多數(shù)天然油脂和人造DAG中主要以1,3-DAG形式存在(1,3-DAG與1,2-DAG比例為7∶3)[5]。一系列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體實(shí)驗(yàn)證明了濃度大于27.3%的DAG具有降低餐后甘油三酯[6-7]、提高脂肪酸的β-氧化[8-9]、降低體重[10-11]等作用。本文建立了高膽固醇血癥大鼠模型，研究DAG對(duì)其血脂及體成分的影響，旨在為DAG的進(jìn)一步研究及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠36只，體重(200±20)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)[SYXK(粵)2017-0080]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室溫20～25℃、濕度40%～70%的動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食和飲水。DAG(1,3-DAG 與1,2-DAG比例7∶3)，廣東粵膳特醫(yī)營養(yǎng)科技有限公司提供。戊巴比妥鈉，廣州顧得生物科技有限公司；4%甲醛，北京索萊寶科技有限公司；生理鹽水等。

1.1.2 動(dòng)物飼料

普通飼料，AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料；普通高脂飼料、大豆油高脂飼料、DAG高脂飼料，在普通飼料的基礎(chǔ)上配制。飼料配方見表1。

表1 大鼠飼料的配方 %

所有飼料委托江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司加工成條狀后，小包獨(dú)立包裝，真空密封，經(jīng)60Co輻照滅菌后保存于實(shí)驗(yàn)室4℃冷庫中，使用前取出。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

羅氏Cobas8000 C702全自動(dòng)生化儀，Discovery ASY-00409直接數(shù)字化雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高膽固醇血癥大鼠模型的建立

在本實(shí)驗(yàn)室條件下給大鼠喂飼普通飼料適應(yīng)1周后，按體重隨機(jī)分成2組，即對(duì)照組(n=12)和模型組(n=24)，兩組大鼠分別飼喂普通飼料和普通高脂飼料30 d。

1.2.2 干預(yù)實(shí)驗(yàn)

將高膽固醇血癥大鼠按照血清總膽固醇水平隨機(jī)分為2組，即TAG組、DAG組，每組12只，分別飼喂大豆油高脂飼料和DAG高脂飼料30 d，建模時(shí)對(duì)照組繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè)

1.2.3.1 一般情況

喂養(yǎng)期間每日觀察動(dòng)物外觀(毛發(fā)色澤、光亮度、稀疏程度)、神態(tài)(精神狀態(tài)、意識(shí)狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度)、活動(dòng)、食欲等一般情況，記錄飼料攝入情況。每周測(cè)量(禁食12 h后)各組大鼠空腹體重、身長。

1.2.3.2 體成分測(cè)定

干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠禁食8.5 h，先注射3%的戊巴比妥鈉將動(dòng)物麻醉(用量0.1 mL/100 g，約30 mg/kg)，再用細(xì)繩將大鼠四肢固定于水平放置的泡沫板上，采用雙能X線吸收法[12]測(cè)量大鼠骨密度及體脂率。

1.2.3.3 血樣采集及分析

大鼠體成分測(cè)定結(jié)束后恢復(fù)飲食4 h，再禁食9 h，采用股動(dòng)脈采血方式每只大鼠采血約10 mL。血液標(biāo)本放置30 min后，4℃、3 000 r/min離心15 min，分離出血清并在4℃冰箱保存待測(cè)。

大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)(總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C))采用全自動(dòng)生化儀[13-14]進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.4 組織病理切片觀察

干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠肝臟，將肝組織固定后，生理鹽水沖洗，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、脫水、HE染色、封片后在顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 高膽固醇血癥大鼠模型的建立

2.1.1 建模期間大鼠體重的變化(見表2)

表2 建模期間大鼠體重的變化 g

注：W0、W1、W2、W3、W4分別表示建模分組時(shí)、第一周末、第二周末、第三周末和第30天的體重；a.與對(duì)照組相比P<0.05。

由表2可見，兩組大鼠體重均隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，且兩組相同喂養(yǎng)時(shí)間的體重除第一周末外差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 建模結(jié)束時(shí)大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)的比較(見表3)

表3 建模結(jié)束時(shí)兩組大鼠血脂指標(biāo)比較 mmol/L

組別 TCTGHDL-CLDL-C對(duì)照組1.65±0.331.07±0.271.33±0.230.23±0.08模型組4.70±1.60a0.78±0.28b1.19±0.254.24±1.83a

注：a.與對(duì)照組比較P<0.01；b.與對(duì)照組比較P<0.05。

由表3可見，建模結(jié)束時(shí)，模型組TC、LDL-C含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，HDL-C含量差異在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明普通高脂飼料喂養(yǎng)30 d，大鼠血脂水平顯著升高，形成了高膽固醇血癥。另外，模型組TG明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，原因是建模飼料配方中缺乏高糖成分[15]。

2.2 干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間大鼠評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化

2.2.1 大鼠體重及飼料利用率(見表4、表5)

由表4可見，在干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠體重均隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，但各組間相同喂養(yǎng)時(shí)間的體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間大鼠體重的變化 g

注：W0、W1、W2、W3、W4分別表示干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組時(shí)、第一周末、第二周末、第三周末和第30天的體重。

表5 干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼料利用率 %

注：飼料利用率=體重增長量/飼料消耗量×100%；a.與對(duì)照組比較P<0.01;b.與TAG組比較P<0.05。

由表5可見：干預(yù)2周時(shí),DAG組飼料利用率明顯高于TAG組和對(duì)照組；干預(yù)3周時(shí)，TAG組飼料利用率高于對(duì)照組與DAG組(P<0.05)；干預(yù)30 d時(shí)，TAG組和DAG組飼料利用率無顯著差異(P>0.05)，但均低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2.2 大鼠身長(見圖1)

由圖1可以看出：干預(yù)1周和2周時(shí)，TAG組大鼠的身長大于其余組別(P<0.05);干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，TAG組和DAG組大鼠身長均大于對(duì)照組(P<0.05)。

注：干預(yù)0周表示建模完成時(shí)；a.與對(duì)照組比較P<0.05;b.與TAG組比較P<0.01。

圖1 干預(yù)實(shí)驗(yàn)期間大鼠身長的變化

2.2.3 大鼠骨密度

干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過雙能X線骨密度儀檢測(cè)大鼠骨密度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，DAG組和TAG組之間大鼠骨密度無明顯差異(P>0.05)，與對(duì)照組比較，DAG組和TAG組骨密度降低(P<0.05)。

注：a.與對(duì)照組比較P<0.05。

2.2.4 大鼠體脂率

干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由雙能X線吸收法測(cè)得大鼠體脂率的數(shù)據(jù)見表6。

表6 大鼠體脂率的變化

由表6可見，DAG組大鼠相比于TAG組和對(duì)照組，體脂率有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)

干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見表7。

表7 大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 mmol/L

注：a.與對(duì)照組相比P<0.05；b.與TAG組相比P<0.05。

由表7可見，DAG組HDL-C含量顯著高于TAG組(P<0.05)，TC、TG和LDL-C含量與TAG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明與TAG相比，DAG使高膽固醇血癥大鼠的血清HDL-C明顯升高(P<0.05)。

2.2.6 大鼠肝臟的形態(tài)

各組大鼠肝臟切片HE染色結(jié)果見圖3。由圖3可見：正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞質(zhì)地較緊密，有條索狀結(jié)構(gòu)，無其他異常變化；TAG組大鼠肝組織細(xì)胞壞死嚴(yán)重，胞核固縮、碎裂，胞質(zhì)被破壞，細(xì)胞脂肪化嚴(yán)重，存在大量脂肪空泡，脂質(zhì)充積于胞質(zhì)，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞；與TAG組相比，DAG組大鼠肝細(xì)胞受損情況及脂肪化程度有明顯好轉(zhuǎn)，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，未見大空泡樣變性。

圖3 各組大鼠肝臟切片HE染色圖像(×200)

2.3 討論

本研究采用由豬油、膽固醇和膽酸鈉等成分構(gòu)成的高脂飼料配方構(gòu)建高膽固醇血癥大鼠模型。高脂飼料喂養(yǎng)30 d，模型組大鼠血清中TC、LDL-C含量均有明顯升高，HDL-C含量降低，表明喂食該配方的高膽固醇飼料可成功建立高膽固醇血癥模型。模型組大鼠血清中TG不升反降，表明該模型比較適用于單純性高膽固醇血癥的研究中，而不適用于高三酰甘油血癥研究。另外，從大鼠的體重變化來看，本實(shí)驗(yàn)采用的高脂飼料對(duì)大鼠體重的影響并不強(qiáng)于普通飼料，高脂模型與肥胖模型有不同定義，血脂變化與體重變化無直接相關(guān)性。

模型構(gòu)建成功后，將其分成了TAG組和DAG組，其中TAG組的高脂飼料中豬油成分替換成大豆油，以保證和DAG組飼料中脂肪酸比例相同(DAG是以一級(jí)大豆油為原料，經(jīng)生物酶法加工工藝得到的新型健康食用油)，DAG組飼料則用DAG全部替換大豆油。各組大鼠喂養(yǎng)30 d，檢測(cè)各組大鼠體成分、血脂水平及肝臟切片病理形態(tài)變化。結(jié)果顯示：高大豆油和DAG飲食會(huì)影響大鼠的骨密度；DAG組大鼠HDL-C含量顯著高于TAG組(P<0.05)，血清中HDL-C含量與冠心病和動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，顯著增加HDL-C的水平表明DAG在抑制體脂積累和預(yù)防心血管疾病方面具有一定的應(yīng)用潛力；持續(xù)喂食高脂、高膽固醇的飼料使TAG組大鼠出現(xiàn)了大量的大型脂肪空泡，而DAG膳食可以減少由高脂、高膽固醇飼料引起的大鼠肝臟中脂質(zhì)的蓄積。需要指出的是，如果在疾病模型中探討DAG降低體脂、優(yōu)化血脂的生理功能，建議延長DAG干預(yù)時(shí)間。為了進(jìn)一步探討DAG對(duì)人體高膽固醇血癥的影響，尚需進(jìn)一步開展大樣本人群的臨床流行病學(xué)研究。

3 結(jié) 論

本研究通過替換飼料中油脂組分對(duì)高膽固醇血癥大鼠做飲食干預(yù)，探討了DAG對(duì)高膽固醇血癥大鼠血脂代謝和體成分的影響。結(jié)果顯示：DAG對(duì)高膽固醇血癥大鼠的血脂具有一定的優(yōu)化效果，DAG不僅可以升高高膽固醇血癥大鼠血清HDL-C，并且可減少脂質(zhì)沉積對(duì)肝臟的損害。