羅 虹，劉凱麗，王 艷

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619)

藥對(duì)是臨床常用的兩味藥物的配對(duì)形式，能起到協(xié)同作用，或增強(qiáng)藥性，或相互制約、緩解毒性[1]。遠(yuǎn)志與石菖蒲伍用，名曰遠(yuǎn)志湯，出自《圣濟(jì)總錄》，可治久心痛。遠(yuǎn)志芳香清冽、辛溫行散、寧心安神、散郁化痰；石菖蒲辛散溫通、利氣通竅、辟濁化濕、理氣化痰、活血止痛。遠(yuǎn)志通于腎、交于心，石菖蒲開(kāi)竅啟閉寧神。二藥伍用，可通心竅、交心腎、益腎健腦聰智，開(kāi)竅啟閉寧神之力增強(qiáng)[2]。

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(polygalatenuifoliawilld.)或卵葉遠(yuǎn)志(polygalasibiricaL.)的干燥根，主要含有三萜皂苷、糖酯類(lèi)化合物以及香豆素、木質(zhì)素、黃酮、生物堿等成分[3]。遠(yuǎn)志味苦、辛，性微溫，歸心、腎、肺經(jīng)，具有寧心安神、祛痰開(kāi)竅、消散癰腫的功效，主治驚悸、失眠健忘、癲癇發(fā)狂、咳嗽痰多、癰疽瘡毒、乳房腫痛等[4]。《名醫(yī)別錄》中云遠(yuǎn)志：“定心氣，止驚悸，益精，去心下膈氣，皮膚中熱，面目黃。”其臨床功效主要為“寧心安神、祛痰開(kāi)竅、消散癰腫”[4]。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖，含揮發(fā)油0.11%～0.42%，包括為β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、石竹烯、α-葎草烯、石菖醚、細(xì)辛醚等，尚含有氨基酸、有機(jī)酸和糖類(lèi)等其他成分[5-6]。石菖蒲性溫，味辛、苦，歸心、胃經(jīng)，具有開(kāi)竅醒神、化濕開(kāi)胃、寧心安神的功效，主治脘痞不饑、噤口下痢、神魂癲癇、健忘耳聾[5-6]?！端幮哉摗吩疲骸爸物L(fēng)濕頑痹，耳鳴，頭風(fēng)，淚下，殺諸蟲(chóng)，治惡瘡疥瘙?！薄渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云：“主風(fēng)寒濕痹，咳逆上氣，開(kāi)心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目，出音聲?！?/p>

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種漸進(jìn)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變性病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、日常生活能力下降和精神行為異常[7]。中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中沒(méi)有阿爾茨海默病這一病名，相關(guān)臨床表現(xiàn)的大量論述散見(jiàn)于癡呆、呆病、善忘、文癡、神呆、郁證等疾病的論述中[8]。皇甫謐在《針灸甲乙經(jīng)》中以“呆癡”命名，虞摶《醫(yī)學(xué)正傳》謂之“愚癡”，《資生經(jīng)》名曰“癡證”，癡呆病名首見(jiàn)于漢代《華佗神醫(yī)外傳》，楊繼洲的《針灸大成》則分別以“呆癡”和“癡呆”命名，明代《景岳全書(shū)·雜證謨》第一次提出“癡呆”是獨(dú)立性疾病[9]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)治療阿爾茨海默病的相關(guān)機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)性質(zhì)，適用于闡釋中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系[10]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

TCMSP V2.3.0數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)、SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Uniprot Database數(shù)據(jù)庫(kù)、DAVID V6.8.0數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape V3.7.0軟件及其Bisogenet插件、CytoNCA插件、ClueGO插件。

1.2 遠(yuǎn)志與石菖蒲中有效成分篩選

通過(guò)TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)數(shù)據(jù)庫(kù)查找相關(guān)文獻(xiàn)，獲取中藥化學(xué)成分相關(guān)信息，以口服生物利用度(OB)≥30%，類(lèi)藥性(DL)≥0.18[11]作為條件，篩選遠(yuǎn)志與石菖蒲中的有效成分。OB為口服藥物吸收至體循環(huán)的速度與程度，反映了藥物生物活性分子類(lèi)藥性的優(yōu)劣[12]。

1.3 藥物有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述步驟篩選出的有效成分名稱(chēng)輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，獲取每一成分的SMILES結(jié)構(gòu)式及2D結(jié)構(gòu)或3D結(jié)構(gòu)，輸入SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得藥物成分靶點(diǎn)，根據(jù)probability≥0.7[13]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

利用Cytoscape3.7.1軟件，將篩選后的遠(yuǎn)志與石菖蒲的主要活性成分名稱(chēng)及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入，生成成分靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)選擇需要的蛋白質(zhì)相互作用，構(gòu)建遠(yuǎn)志、石菖蒲藥物有效成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 阿爾茲海默病相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://db.idrblab.org/ttd/)中Search drugs and targets by desease or ICD identifier一欄輸入疾病的英文名稱(chēng)(Alzheimer disease)獲得疾病一級(jí)靶點(diǎn)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇Disease name一欄，輸入Alzheimer disease，搜索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，兩種方法得到的靶點(diǎn)取交集確定為疾病相關(guān)的靶點(diǎn)[14]。使用Uniprot Database數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)選擇物種為“human”的靶點(diǎn)，將蛋白名稱(chēng)和基因名稱(chēng)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

利用Cytoscape軟件將疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape得到疾病靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入基因列表，構(gòu)建疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。原則：物種智人(Homo Sapiens)。

1.5 交集網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及生物通路分析

先利用Bisogenet插件分別構(gòu)建藥物成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，再采用Cytoscape中的merge工具得到一個(gè)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape中的CytoNCA插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行評(píng)估分析，選擇degree值≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，得到一個(gè)更細(xì)致的交集網(wǎng)絡(luò)。使用DAVIAD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，選擇GO分析和KEGG分析，得到富集分析通路，進(jìn)行進(jìn)一步討論。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志及石菖蒲有效成分篩選

按照上述篩選條件得到石菖蒲活性成分4個(gè)，從文獻(xiàn)中篩選出石菖蒲活性成分2個(gè)，共計(jì)6個(gè)，分別為木脂素類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、揮發(fā)油等成分。遠(yuǎn)志活性成分6個(gè)[15-16]，為皂苷類(lèi)、甾醇類(lèi)等成分。兩藥共篩選得到12個(gè)活性成分(如表1)，獲取180個(gè)靶點(diǎn)蛋白，根據(jù)probability≥0.7[13]篩選得到靶點(diǎn)共44個(gè)。

表1 遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)中的12個(gè)活性成分

2.2 遠(yuǎn)志-石菖蒲有效成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的12個(gè)活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)相連構(gòu)建成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。40個(gè)靶點(diǎn)中，除2個(gè)靶點(diǎn)沒(méi)有產(chǎn)生交互關(guān)系，其余38個(gè)節(jié)點(diǎn)均有交互關(guān)系，產(chǎn)生68條邊，degree(節(jié)點(diǎn)通過(guò)邊的個(gè)數(shù))平均值為3.58，平均聚類(lèi)系數(shù)為0.441，P-value<0.01。

圖1成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 阿爾茲海默病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

在 TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中與阿爾茨海默病有關(guān)的一級(jí)靶點(diǎn)共95個(gè)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中與阿爾茨海默病相關(guān)的靶點(diǎn)有30個(gè)，對(duì)兩種方法得到的靶點(diǎn)取交集，共得到14個(gè)阿爾茨海默病一級(jí)靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。構(gòu)建疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，14個(gè)靶點(diǎn)中有1個(gè)沒(méi)有參與蛋白相互作用，13個(gè)靶點(diǎn)有蛋白相互作用。網(wǎng)絡(luò)圖包括13個(gè)節(jié)點(diǎn)，31條邊，節(jié)點(diǎn)度degree平均值為4.43，平均聚類(lèi)系數(shù)為0.492，P-value<0.01。

表2 阿爾茨海默病靶點(diǎn)

圖2疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 遠(yuǎn)志-石菖蒲有效成分靶點(diǎn)與阿爾茨海默病靶點(diǎn)交集網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape中的merge工具得到一個(gè)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集網(wǎng)絡(luò)，共287個(gè)節(jié)點(diǎn)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示該交集網(wǎng)絡(luò)的degree中位值為11，設(shè)定篩選范圍為degree值≥22，共76個(gè)節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。其中有兩個(gè)靶點(diǎn)沒(méi)有產(chǎn)生互交，74個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生363條互交關(guān)系，節(jié)點(diǎn)度degree的平均值為9.55，平均聚類(lèi)系數(shù)為0.553，P-value<0.01。

2.5 生物通路分析結(jié)果

將交集網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)的基因鍵入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行KEGG分析和GO分析。KEGG分析共導(dǎo)出通路74條，GO分析共導(dǎo)出263條，選擇P<0.01[11]的通路，再按照相關(guān)性排序，結(jié)合文獻(xiàn)篩選得到KEGG通路5條(見(jiàn)表3)，GO通路2條(表4)。KEGG分析結(jié)果顯示，PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路可能是遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)治療阿爾茨海默病的相關(guān)信號(hào)通路。GO分析結(jié)果顯示，beta-catenin-TCF復(fù)合物組裝、MAPK級(jí)聯(lián)(MARK cascade)等通路與遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)治療阿爾茨海默病有關(guān)。

圖3成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 KEGG分析結(jié)果

表4 GO分析結(jié)果

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建遠(yuǎn)志-石菖蒲成分靶點(diǎn)及阿爾茨海默病相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)分子水平上揭示遠(yuǎn)志-石菖蒲治療阿爾茨海默病的機(jī)制進(jìn)行探索。通過(guò)藥物化學(xué)成分分析，得到遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)主要有效成分12個(gè)。藥物有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集圖印證了遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)治療阿爾茨海默病涉及多個(gè)活性成分、靶標(biāo)以及通路。生物通路分析結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)治療阿爾茲海默病的機(jī)制與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等有關(guān)。

PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶)信號(hào)通路是維持細(xì)胞正常生理功能的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化、遷移、骨架重排等生理過(guò)程，同時(shí)具有肯定的抗凋亡效應(yīng)[17]。 PI3K-Akt信號(hào)通路與阿爾茨海默病的發(fā)生與發(fā)展具有一定的聯(lián)系，通過(guò)改變PI3K-Akt信號(hào)通路表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)[18]。PI3K被細(xì)胞外信號(hào)活化后，可激活下游蛋白激酶Akt。在阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程中，凋亡相關(guān)基因Bad、GSK-3、轉(zhuǎn)錄因子家族、caspases家族等參與了神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元的大量丟失，而活化的Akt通過(guò)磷酸化Bad、GSK-3、轉(zhuǎn)錄因子家族、IB、caspases等使促凋亡基因失活，從而起到抑制神經(jīng)元凋亡及促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用，進(jìn)而減少阿爾茨海默病神經(jīng)元的大量丟失，改善阿爾茨海默病的病理變化[19]。激活PI3K-Akt信號(hào)通路可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，緩解HIBI引起的神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[20-21]。

ErbB信號(hào)不足與神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展有關(guān)，如阿爾茨海默病[22]。有證據(jù)表明，NRG/ERbB信號(hào)在大腦中存在一個(gè)最優(yōu)水平，偏離這一水平會(huì)損害大腦功能[23]。阿爾茨海默病中的突觸丟失、膠質(zhì)增生、炎癥和神經(jīng)元死亡等病理變化與神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)及其受體erbB2、erbB3和erbB4的表達(dá)改變有關(guān)[24]。

在雌激素信號(hào)通路中，雌激素激活雌激素受體ER和GPR30。阿爾茨海默癥患者中有2/3為女性，該病女性患病率高與絕經(jīng)期間卵巢性激素的喪失有關(guān)[25]。阿爾茨海默患者大腦白質(zhì)中雌激素受體β顯著減少[26]，雌激素受體β的作用之一在于降低阿爾茨海默病大鼠海馬體中的炎癥反應(yīng)水平和β淀粉樣蛋白沉積程度，并提高學(xué)習(xí)和記憶能力[27]。

MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的一條蛋白質(zhì)鏈，其將細(xì)胞表面受體的信號(hào)傳遞給細(xì)胞核內(nèi)的DNA，非正常MAPK級(jí)聯(lián)的功能與癌癥、糖尿病、自身免疫性疾病和發(fā)育異常等疾病的誘導(dǎo)和發(fā)展有關(guān)[28]。

4 結(jié)論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)中的有效成分治療阿爾茨海默病可能通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等發(fā)揮作用。本研究為該藥對(duì)健腦作用的相關(guān)機(jī)制提出了預(yù)測(cè)，為其進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。