雷蕊綺 蔣 力 辜剛鳳 彭紅艷 李經(jīng)倫

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

一氧化碳(CO)是含碳物質(zhì)燃燒不完全的產(chǎn)物，毒性極強，急性CO中毒致死率超過50%[1]，約3%～40%的急性CO中毒患者經(jīng)早期治療好轉(zhuǎn)后，經(jīng)歷2～6周表現(xiàn)正常的“假愈期”，出現(xiàn)以認知功能障礙為主的一系列神經(jīng)精神癥狀，稱為急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)[2,3]，其發(fā)病機制尚不明確，目前缺乏有效的治療方案。有相關(guān)研究表明細胞凋亡參與DEACMP的發(fā)生，急性CO中毒后組織嚴重缺氧及CO本身的毒性作用啟動細胞凋亡進程，隨著病程的進展，神經(jīng)細胞損傷加劇，從而出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)功能缺損癥狀[3-5]。

核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是細胞凋亡信號中關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，其激活后進入細胞核，可誘導(dǎo)下游因子轉(zhuǎn)錄活化。近年來研究發(fā)現(xiàn)NF-κB凋亡信號通路參與認知功能障礙的發(fā)生[6,7]。C-myc是NF-κB信號通路中重要的下游促凋亡因子[8]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)可特異性抑制NF-κB激活，其分子量小、容易透過血腦屏障[7,9]。Kan等[7]研究發(fā)現(xiàn)PDTC通過阻斷NF-κB信號通路，可減輕脂多糖所致的神經(jīng)炎癥和細胞凋亡，從而改善大鼠的認知功能。NF-κB/C-myc信號通路與DEACMP的相關(guān)性研究甚少，本實驗通過建立DEACMP大鼠模型，采用PDTC進行干預(yù)，觀察大鼠的行為學(xué)變化、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)改變和NF-κB/C-myc信號通路的表達，從而進一步探討NF-κB/C-myc信號通路在DEACMP發(fā)生過程中的調(diào)控作用，為DEACMP的基礎(chǔ)研究及治療提供一定的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康SD雄性大鼠，SPF級，160只(220～250 g)，購于瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-17]。

1.1.2主要實驗儀器、試劑 CO氣體(純度99.9%，瀘州市西南化工研究所)，Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(由西南醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院實驗室提供)，血氣分析儀(雅培公司，美國)，PDTC(Sigma公司，美國)，TUNEL試劑盒(Roche公司，德國)，兔抗鼠NF-κB P65、C-myc多克隆IgG一抗(CST公司，美國)，CY3標記山羊抗兔IgG二抗(阿斯本生物技術(shù)有限公司，武漢)。

1.2方法

1.2.1動物篩選 將160只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機編號，進行為期6 d的Morris水迷宮訓(xùn)練，視頻分析系統(tǒng)記錄大鼠逃避潛伏期小于120 s的視為合格，將不合格動物淘汰。

1.2.2動物分組 訓(xùn)練合格的150只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為3 組：空氣組(NC組，n= 50)，CO中毒組(CO組，n=50)，CO中毒+PDTC組(PCO組，n=50)。

1.2.3動物模型制備 參照張奕雯等[10]的方法利用間隔腹腔注射純品CO氣體法制備DEACMP大鼠，CO組、PCO組首次按100 ml/kg腹腔注射CO氣體，每間隔4 h半量(50 ml/kg )追加1次，共3次；NC組腹腔注射等量空氣。染毒后使用血氣分析儀動態(tài)監(jiān)測鼠股動脈血碳氧血紅蛋白(HbCO)濃度，并觀察大鼠染毒后的表現(xiàn)。PCO組在首次染毒后0.5 h腹腔注射PDTC 1次(劑量為100 mg/kg，用 0.9% NS按 1 mg/ml 濃度配比，現(xiàn)配現(xiàn)用)，每天1次，直至處死；CO組和NC組腹腔注射等量無菌生理鹽水。

1.2.4Morris 水迷宮實驗 各組大鼠分別在染毒后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d各時相點，參照Morris的方法進行定位航行實驗和空間探索實驗，記錄120 s內(nèi)平均逃避潛伏期及跨越平臺區(qū)域的次數(shù) 。

1.2.5組織標本采集 各亞組在水迷宮實驗完成后，用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)生理鹽水左心室灌注，4% 多聚甲醛固定，取出大腦組織，置于4%多聚甲醛中過夜，脫水、石蠟包埋，切片備用。

1.2.6免疫熒光染色 每只大鼠選取3張連續(xù)腦組織標本切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS液浸洗，高溫修復(fù)抗原，避光孵育10 min，浸洗，5%BSA封閉20 min，孵育一抗，4℃過夜，PBS浸洗，加熒光二抗(避光操作)，37℃孵育50 min，浸洗，加 50～100 ml DAPI染核，在室溫下避光孵育 5 min，PBS洗滌，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下采集圖像，采用MicroPublisher成像系統(tǒng)觀察并處理每個視野下的吸光度值。

1.2.7HE染色 各組大鼠石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)蘇木素-伊紅染色，脫水封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8TUNEL熒光染色 組織標本切片常規(guī)脫蠟至水，嚴格按照TUNEL染色試劑盒說明書步驟進行,沖洗封片，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。定量分析方法：每只大鼠隨機選取海馬CA1區(qū)5個不同視野(×400)計數(shù)凋亡陽性細胞數(shù)，并計算平均值。

2 結(jié)果

2.1大鼠染毒后表現(xiàn)及動脈血HbCO濃度監(jiān)測 大鼠腹腔注射CO氣體后，逐漸表現(xiàn)出活動增多、煩躁、撞籠，10～15 min后開始出現(xiàn)四肢癱軟、少動、目光呆滯、口唇及四肢末端呈現(xiàn)櫻桃紅色，部分大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、角弓反張，甚至昏迷。同籠大鼠聚集在一起，無主動進食、水；將大鼠放置于通風(fēng)處，末次染毒7～9 h 后上述癥狀逐漸消失，大鼠恢復(fù)正常進食及活動。有少數(shù)大鼠染毒后死亡，CO組5只、PDTC組3只，死亡大鼠用備用鼠補充。解剖死亡大鼠，可見腦組織及腹腔臟器充血水腫明顯，NC組無上述表現(xiàn)。CO染毒后0.5 h鼠股動脈血HbCO濃度可達70%以上，染毒后2～4 h動脈血HbCO濃度開始逐漸下降，在50%～60%范圍內(nèi)。分3次間隔4 h追加半量CO氣體后，染毒后4～18 h血HbCO濃度可維持在50%以上，而NC組動脈血HbCO濃度小于5%。

2.2Morris 水迷宮實驗 水迷宮圖像分析系統(tǒng)記錄染毒后1～7 d NC組、CO組、PCO組大鼠平均逃避潛伏期、跨越平臺次數(shù)無明顯差異(P>0.05)。隨著CO中毒病程的推移，至染毒后14～21 d CO組逃避潛伏期較NC組顯著延長、跨越平臺次數(shù)減少，各組內(nèi)及組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；染毒后14～21 d，PCO組行為學(xué)改變介于NC組及CO組之間(P<0.05)，見圖1。

2.3免疫熒光結(jié)果 CO組各時間點海馬CA1區(qū)NF-κB、 C-myc蛋白表達明顯高于NC組(P<0.05)，呈升高(1 d)-高峰(3～7 d)-逐漸下降(14～21 d)的趨勢，至21 d仍高于染毒前水平，組內(nèi)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。染毒后1 d PCO組海馬CA1區(qū)各時間點NF-κB、 C-myc蛋白與CO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，染毒3 d以后 PCO組NF-κB、 C-myc蛋白表達較CO組明顯減少(P<0.05)；PCO組蛋白表達與NC組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、2，圖2、3。

2.4HE染色 NC組各時間點組織切片染色可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)整，胞核正常。CO組各時間點可見神經(jīng)細胞腫脹，數(shù)目略減少，可見壞死細胞，胞核濃縮。以染毒后第7天病理改變最明顯，除上述表現(xiàn)外可見大量壞死細胞，細胞排列紊亂，界限模糊，胞體形態(tài)不完整，胞質(zhì)稀少，胞核固縮深染，呈不規(guī)則形。14～21 d時細胞水腫逐漸減輕，仍有明顯細胞壞死表現(xiàn)。PCO組海馬組織形態(tài)學(xué)改變介于NC組和PCO組之間，見圖4。

2.5細胞凋亡結(jié)果 NC組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞極少，CO組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)明顯高于NC組(P<0.05)。CO組海馬CA1區(qū)陽性細胞數(shù)在染毒后1 d升高，隨著染毒時間延長呈遞增趨勢，于7 d達高峰，后逐漸下降，各亞組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；染毒3 d以后，PCO組凋亡細胞數(shù)較CO組顯著減少(P<0.05)，但仍高于NC組(P<0.05)；見表3、圖5。

圖1 三組大鼠各時間點逃避潛伏期(A)和跨越平臺次數(shù)(B)Fig.1 Results of escape latency test(A)and frequency of going through platform in each group(B)Note:Compared with NC group,*.P P

Groupsn1 d3 d7 d14 d21 dNC group101.34±0.791.68±1.061.42±0.831.27±0.951.37±0.76CO group108.41±1.691)25.16±2.761)2)21.99±5.031)2)13.44±3.161)7.76±1.981)PCO group106.41±1.921)12.67±3.631)3)9.61±3.711)3)7.62±2.781)3)4.51±1.601)3)F16.6556.6024.2717.9213.02P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with the other time points(1 d，14 d，21 d)of CO group,2)P<0.01;compared with CO group,3)P<0.05.

Groupsn1 d3 d7 d14 d21 dNC group101.20±0.741.20±0.811.33±0.951.20±0.801.21±0.74CO group107.52±1.371)17.53±1.621)2)17.24±1.271)2)10.67±1.731)9.05±1.571)PCO group105.59±1.061)9.19±3.451)3)9.79±3.791)3)5.93±1.501)3)5.62±1.391)3)F26.7439.4533.8034.2328.11P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with the other time points(1 d，14 d，21 d)of CO group,2)P<0.05;compared with CO group,3)P<0.05.

圖2 染毒后3 d大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB 免疫熒光染色結(jié)果(×400)Fig.2 Immunofluorescence results of NF-κB in hippoca-mpus CA1 region at 3th day(×400)

圖3 染毒后3 d大鼠海馬CA1區(qū)C-myc免疫熒光染色結(jié)果(×400)Fig.3 Immunofluorescence results of C-myc in hippoca-mpus CA1 region at 3th day(×400)

Groupsn1 d3 d7 d14 d21 dNC group102.16±0.282.23±0.352.15±0.562.43±0.861.97±0.52CO group107.42±2.381)10.17±2.561)16.41±2.861)2)10.92±1.411)8.48±2.021)PCO group105.34±0.461)5.99±0.781)3)8.78±2.131)3)7.43±2.011)3)5.19±1.811)3)F10.6419.5435.2624.1812.56P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with the other time points of CO group,2)P<0.05;compared with CO group,3)P<0.05.

圖4 染毒后7 d 三組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色(×400)Fig.4 Results of HE staining of each group in hippocampus CA1 region at 7th day(×400)Note:A.NC group;B.CO group;C.PCO group.

圖5 染毒后7 d 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡情況(×400)Fig.5 Apoptosis of neurons in hippocampus CA1 region at 7th day(×400)

3 討論

DEACMP病程中“假愈期”的存在使得大量患者延誤診治，造成嚴重后果。海馬是高等動物學(xué)習(xí)記憶與認知功能形成的關(guān)鍵部位，海馬CA1區(qū)對缺血缺氧損傷最為敏感[4,11]。本實驗采用腹腔注射CO氣體法制備DEACMP大鼠模型，染毒后大鼠出現(xiàn)了典型的急性CO中毒表現(xiàn)，且鼠股動脈血HbCO濃度大于50%并持續(xù)16 h以上，符合DEACMP模型標準[10,12]。CO組與NC組比較，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡明顯(P<0.05)，于染毒后7 d達高峰；染毒后14～21 d 大鼠出現(xiàn)了明顯的學(xué)習(xí)與記憶能力受損，以上結(jié)果表明大鼠DEACMP的發(fā)生與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞遲發(fā)性損傷密切相關(guān)，與Guan[11]、Nabeshima等[13]研究結(jié)果類似。

NF-κB是由REL家族組成的一類核蛋白因子的總稱，廣泛存在于神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及腦血管內(nèi)皮細胞中，其主要活性形式是P50/P65 二聚體[14]。在靜息狀態(tài)下，p50/65 二聚體與其抑制劑 IκB 結(jié)合；當(dāng)神經(jīng)細胞受到外界刺激,IκB 泛素化繼而被蛋白酶水解,活化的p50/65 二聚體進入細胞核,可促進多種細胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)蛋白等轉(zhuǎn)錄活化，所以NF-κB對神經(jīng)系統(tǒng)損傷調(diào)控具有雙重作用[14,15]。C-myc是NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游促細胞凋亡因子之一，NF-κB活化調(diào)控C-myc轉(zhuǎn)錄表達，C-myc和同源轉(zhuǎn)錄因子Max 形成異二聚體，通過鳥苷酸脫羧酶介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡[8,16]。

本實驗發(fā)現(xiàn)急性CO中毒早期(1～3 d)海馬CA1區(qū)NF-κB表達迅速升高，調(diào)控凋亡因子C-myc轉(zhuǎn)錄，中毒早期細胞凋亡可清除損傷細胞、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境；同時NF-κB可激活神經(jīng)營養(yǎng)因子、凋亡抑制蛋白、抗炎因子、鈣調(diào)蛋白等表達，可減輕炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣，起到保護神經(jīng)細胞的作用[14,15]；此時海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞損傷輕微，大鼠尚未出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力損傷。隨著染毒時間延長，組織缺氧損傷、炎癥反應(yīng)等可促進NF-κB信號通路持續(xù)活化，NF-κB、C-myc表達至染毒后3～7 d 達高峰，凋亡因子的持續(xù)表達及神經(jīng)營養(yǎng)因子的耗竭使得細胞損傷加劇，至染毒后7 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞損傷達到高峰。染毒后21 d海馬CA1區(qū)NF-κB、C-myc蛋白表達仍明顯高于NC組(P<0.05)，NF-κB介導(dǎo)的細胞凋亡持續(xù)到染毒末期，海馬神經(jīng)細胞廣泛的病理損傷導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)行為學(xué)異常，染毒后期(14～21 d)Morris 水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)大鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。證實急性CO中毒后，NF-κB介導(dǎo)的細胞凋亡因子持續(xù)表達促使海馬神經(jīng)細胞損傷進行性加重，致急性CO中毒大鼠發(fā)生遲發(fā)性腦病。

PDTC是一種氨基甲酸鹽類抗氧化劑，通過抑制IκB 的降解、減少 NF-κB p65的核移位等方式，在NF-κB活化過程的不同階段發(fā)揮抑制作用[9]。有研究表明，PDTC還有清除細胞活性氧中間產(chǎn)物、減輕炎癥反應(yīng)、保護線粒體功能等作用[7,9]。Wan等[9]研究證實PDTC干預(yù)后在胞漿內(nèi)達到一定濃度才可有效抑制NF-κB活化，急性CO中毒早期，PCO組海馬CA1區(qū)NF-κB、C-myc蛋白表達、細胞凋亡與CO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但較NC組明顯升高(P<0.05)，可能與PDTC作用時間短、胞漿藥物濃度不足有關(guān)。至染毒3 d以后，PCO組NF-κB、C-myc蛋白表達和凋亡細胞減少(P<0.05)，隨著作用時間延長，PDTC干預(yù)NF-κB凋亡信號通路和保護神經(jīng)細胞的作用更加明顯，至染毒后期大鼠認知功能較CO組有所改善。

本研究結(jié)果表明NF-κB、C-myc蛋白參與DEACMP海馬神經(jīng)細胞凋亡的進程，PDTC通過特異性阻斷NF-κB信號通路，抑制下游凋亡因子C-myc持續(xù)過量的表達，使大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞損傷的速度延緩、程度減輕，從而對DEACMP的進展和預(yù)后產(chǎn)生影響。NF-κB信號通路激活和細胞凋亡受到多種因素的影響，該如何有效調(diào)控DEACMP發(fā)生過程中NF-κB凋亡信號通路轉(zhuǎn)錄表達，以及PDTC的給藥途徑和作用時間，均有待進一步的實驗研究，以開辟治療DEACMP的新途徑。