諶宇翔 譚志堅(jiān) 歐輝躍

【摘要】目的：研究洛伐他?。↙ovastatin，LOV）對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（endothelial cell-derived growth factor， VEGF）表達(dá)的影響。方法：成年昆明小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、給藥組（LOV低、高濃度）3組，每組8只小鼠。將1mg/ml的鹽酸腎上腺素用0.9%生理鹽水稀釋1.5倍，于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm對(duì)三組都予以皮下注射，鹽酸腎上腺素0.05 ml/100 g，連續(xù)5天，建立內(nèi)皮損傷模型。建模成功后，各組小鼠分別給予洛伐他?。?、15mg/Kg）進(jìn)行灌胃，對(duì)照組給予0.3ml生理鹽水灌胃。六周后免疫組化檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈VEGF的表達(dá)。結(jié)果：灌胃6周后，免疫組化顯示，與對(duì)照組相比，給藥組小鼠主動(dòng)脈VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，且濃度越高，VEGF表達(dá)越強(qiáng)。結(jié)論：LOV通過(guò)促進(jìn)VEGF的表達(dá)改善和治療內(nèi)皮損傷，LOV對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后VEGF的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】洛伐他汀 ?主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷 ?血管 ?內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

引言：內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是血管壁內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化 （athero-

sclerosis， AS）發(fā)生發(fā)展的早期啟動(dòng)因素 。而洛伐他汀屬于調(diào)整血脂藥， 是臨床上常用的降血脂、預(yù)防心腦血管疾病的藥物。他汀類藥物對(duì)血管內(nèi)皮損傷也有明顯的改善作用 。但是其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察洛伐他汀對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后VEGF表達(dá)的影響，初步探討洛伐他汀可能的機(jī)制。

一、材料與方法

（一）藥物試劑與儀器

成年昆明小鼠24只，雌雄各半，鹽酸腎上腺素，戊巴比妥鈉，VEGF免疫組化S-P試劑盒，HE染色試劑盒，洛伐他汀，生理鹽水等

（二）動(dòng)物分組及模型制備

隨機(jī)選取16只小鼠作為給藥組，8只作為對(duì)照組。將1 mg/ml的鹽酸腎上腺素用0.9%生理鹽水稀釋1.5倍，三組小鼠均于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm在皮下注射稀釋后的鹽酸腎上腺素0.05 ml/100 g，連續(xù)5天，自第4天起每二次給藥中間時(shí)間將小鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min，共4次。

（三）病理學(xué)標(biāo)本制備

60℃烤片12h;切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇，每級(jí)放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min;蘇木素染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán);伊紅染3～5min，蒸餾水沖洗;梯度酒精（95-100%）脫水，每級(jí)5 min（或者直接把片子烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。

（四）免疫組化檢測(cè)VEGF的表達(dá)

60℃烤片12 h;切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每級(jí)放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min;熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮20min后，冷卻10min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后0.01M PBS（pH7.2～7.6）洗滌3 min x 3次;加入1%高碘酸，室溫20 分鐘以滅活內(nèi)源性酶。PBS沖洗3 min x 3次;孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（VEGF），4℃過(guò)夜。PBS沖洗5 min x 3次;孵育二抗：滴加50～100 μL抗-小鼠-IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min x 3次;DAB顯色： 滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min， 鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌;蘇木素復(fù)染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán);各級(jí)酒精（60-100%）脫水，每級(jí)5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。

二、結(jié)果

于第6天晨，分別任意抽取對(duì)照組、給藥組各2只小鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（4.5 mg/100 g），取主動(dòng)脈HE染色觀察。結(jié)果顯示造模成功。造模成功后，將給藥組的14只小鼠隨機(jī)分為洛伐他汀低、高（5、15 mg /kg）兩個(gè)劑量組。除通過(guò)灌胃灌進(jìn)不同劑量的洛伐他汀外，其余條件皆與對(duì)照組相同。6周后測(cè)量大鼠主動(dòng)脈VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組（圖A）相比，給藥組（圖B、C）VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與洛伐他汀低劑量組（圖B）（5mg/kg）相比，洛伐他汀高劑量組（圖C）（15mg/kg）表達(dá)更強(qiáng)。

三、討論

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性、進(jìn)行性、多因素的系統(tǒng)性疾病，是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)指出，血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈硬化的最初使動(dòng)因素，動(dòng)脈硬化患者早期的表現(xiàn)就是內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮細(xì)胞功能不全。功能紅曲有效成分洛伐他?。↙ovas-tatin）是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂作用。

洛伐他汀除了具有顯著的降血脂效果外，還能明顯地改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能、抗炎和抗增殖，促進(jìn)一氧化氮合成酶（eNOS）的產(chǎn)生，從而增加NO的合成和釋放，這對(duì)血管內(nèi)皮有著許多積極意義。多項(xiàng)研究指出， 他汀類藥物在降低血脂及心血管事件中有良好的預(yù)防和治療作用。另有研究表明他汀類藥物對(duì)機(jī)體一些部位VEGF的表達(dá)有促進(jìn)作用。VEGF是一種特異性較高的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能，在加重和形成AS方面發(fā)揮重要作用。但綜合已知文獻(xiàn)，目前對(duì)于他汀類藥物預(yù)防和治療機(jī)制的研究尚不是很明確。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察洛伐他汀對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后VEGF表達(dá)的影響，初步探討洛伐他汀可能的機(jī)制。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比給藥組VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與洛伐他汀低劑量組（5mg/kg）相比，洛伐他汀高劑量組（15mg/kg）表達(dá)更強(qiáng)。綜上所述，LOV通過(guò)促進(jìn)VEGF的表達(dá)改善和治療內(nèi)皮損傷。LOV對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后VEGF的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

本次實(shí)驗(yàn)的不足：由于經(jīng)費(fèi)有限，本次實(shí)驗(yàn)只設(shè)置了高低兩個(gè)劑量組并未設(shè)置更多的劑量梯度，因此無(wú)法進(jìn)行更加細(xì)致的比較。另外本次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)造模第6天、灌胃6周的小鼠后進(jìn)行HE染色取材觀察，灌胃六周后的小鼠進(jìn)行了免疫組化觀察，因此只能了解始末的變化，無(wú)法細(xì)致的了解其中間的變化過(guò)程，下一步實(shí)驗(yàn)可以做與此相關(guān)的進(jìn)一步研究或者他汀類藥物對(duì)不同組織如睪丸，腦組織等損傷后VEGF表達(dá)的影響。

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