陳景智，王力超，李亮，葉秀云，林娟

(福州大學(xué)，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350116)

紅曲，在我國(guó)已有1000多年歷史，是古代食療兩用的中藥材[1]，紅曲中含有多種功能性成分，如紅曲色素、氨基丁酸、洛伐他汀、麥角甾醇等[2]，還含有淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、酯化酶等多種酶類(lèi)物質(zhì)[3-5]，具有很好的研究意義。

洛伐他汀為日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章于1979年從紅色紅曲霉菌(Monascusrubber)的發(fā)酵液中分離出來(lái)，發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)烈抑制膽固醇合成的作用，命名為Monacolin K[6]。之后，遠(yuǎn)藤章又相繼分離出Monacolin J、Monacolin L[7]、Monacolin X[8]和Monacolin M[9]，將這些物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為Monacolins，但Monacolin K還是主要作用物質(zhì)。

隨著人們生活水平的日益提高，患有心血管疾病的人越來(lái)越多，洛伐他汀作為治療心血管疾病的理想藥劑[10-11]，需求量日益增大，但生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)量低、周期長(zhǎng)、成本高等問(wèn)題限制了紅曲洛伐他汀的實(shí)際應(yīng)用。因此，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室選育得到的高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉突變株R”-30進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵和分離純化工藝研究，為工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與試劑

紅曲霉突變株R”-30(MonascusR”-30)，由福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用基因組重排技術(shù)選育得到。

蛋白胨購(gòu)于Oxiod公司；柱層析用硅膠：80～120目，購(gòu)自青島海洋化工有限公司； Sephadex LH20，購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；酵母膏、甘油、葡萄糖、乙酸乙酯、MgSO4·7H2O、NaNO3、ZnSO4·7H2O、KH2PO4等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWYR-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司)；CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司； D-2000 Elite型高壓液相色譜儀，日本HITACHI。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：配制方法參照文獻(xiàn)[12]。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨20，酵母膏20，黃豆粉10，甘油(分析純)50，MgSO4·7H2O 1，NaNO32，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，甘油(分析純)50，蛋白胨10，酵母膏10，NaNO32，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

無(wú)碳源發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏10，MgSO4·7H2O 1，NaNO32，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

無(wú)氮源發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，甘油50，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

缺無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，甘油50，蛋白胨10，酵母膏10，NaNO32。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洛伐他汀測(cè)定方法

1.2.1.1 紫外分光光度法

洛伐他汀在229、237和246 nm處有最大紫外吸收，其中以237 nm處吸光值最大，可通過(guò)測(cè)量OD237來(lái)初步判定洛伐他汀含量的高低[13]。取1 mL發(fā)酵液，加入9 mL乙醇(70%)振蕩混勻，55 ℃，130 r/min 振蕩提取1 h；4 200 r/min離心5 min，取上清，適當(dāng)稀釋后測(cè)量OD237。

1.2.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

(1)HPLC檢測(cè)條件[14]

色譜柱：HITACHI LaChromUltra C18(5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶0.01%磷酸=60∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：28 ℃。

(2)洛伐他汀(內(nèi)酯型)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取洛伐他汀內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容至25 mL，得到200 mg/L的母液，系列稀釋得到5，10，50，100，150 mg/L的樣品。以洛伐他汀濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)繪制洛伐他汀濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

由圖1可知，當(dāng)洛伐他汀濃度在0～200 mg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，R2=0.998 4，回歸方程為y=16 689x-1 202.6，內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖2所示。

圖1 洛伐他汀(內(nèi)酯型)濃度與峰面積關(guān)系曲線Fig.1 Curve of lovastatin(lactone form) concentration and peak area

圖2 洛伐他汀(內(nèi)酯型)標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of standard substance concentration and peak area of lovastatin(lactone form)

(3)洛伐他汀開(kāi)環(huán)酸型溶液制備方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取洛伐他汀內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加4 mL甲醇溶解，加20 mL 0.2 mol/L NaOH溶液混勻后采用超聲波處理30 min，取出冷卻，用3 mol/L H3PO4調(diào)pH至6左右，加甲醇定容至25 mL，然后進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，若洛伐他汀內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)品全部轉(zhuǎn)化為開(kāi)環(huán)酸型，則洛伐他汀開(kāi)環(huán)酸型濃度約為200 mg/L。

(4)洛伐他汀(開(kāi)環(huán)酸型)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

方法同內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。由圖3可知洛伐他汀濃度在0～200 mg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，R2=0.995 32，回歸方程：y=20 339x+21 205。開(kāi)環(huán)酸型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖，如圖4所示。

圖3 洛伐他汀(開(kāi)環(huán)酸型)濃度與峰面積關(guān)系曲線Fig.3 Curve of lovastatin(acid form) concentration and peak area

圖4 洛伐他汀(開(kāi)環(huán)酸型)標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of standard concentration and peak area substance of lovastatin (acid form)

(5)發(fā)酵液中洛伐他汀的檢測(cè)

取1 mL發(fā)酵液，加入70%乙醇9 mL振蕩混勻， 55 ℃，130 r/min振蕩提取1 h，4 200 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取濾液采用HPLC檢測(cè)洛伐他汀含量，如方程(1)所示。

ρ(內(nèi)酯型洛伐他汀)/mg·L-1)=(y+1 202.6)/16 689×稀釋倍數(shù)

(1)

式中：y—內(nèi)酯型洛伐他汀峰面積。

ρ(開(kāi)環(huán)酸型洛伐他汀)/(mg·L-1)=(y-21 205)/20 339×稀釋倍數(shù)

(2)

式中：y—酸型洛伐他汀峰面積。

1.2.2 紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1)碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響：分別選取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、半乳糖、麥芽糖6種碳源添加到缺碳發(fā)酵培養(yǎng)基中(添加量均為2%表示100 mL 發(fā)酵液添加2 g碳源)，考察不同碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響；確定最適碳源后，進(jìn)一步研究不同添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)的影響。

(2)氮源對(duì)產(chǎn)洛伐他汀的影響：分別取有機(jī)氮源—蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿、黃豆粉等(添加量1%)；無(wú)機(jī)氮源—NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4(添加量0.2%)添加到缺氮培養(yǎng)基中，考察不同氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響。確定最佳氮源后，進(jìn)一步研究不同添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)的影響。

(3)無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)洛伐他汀的影響：選擇KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4(添加量0.1%)添加到缺無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，考察不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響。確定最佳無(wú)機(jī)鹽后，進(jìn)一步研究不同添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)的影響。

(4)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽配比的正交試驗(yàn)：在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交試驗(yàn)研究各自適宜的添加量。利用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定這些因素的最優(yōu)配比。因素水平編碼如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表 單位：%Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 紅曲霉發(fā)酵條件的優(yōu)化

(1)培養(yǎng)基初始pH的影響：調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別為4、5、6、7、8，研究不同初始pH對(duì)菌株產(chǎn)洛伐他汀的影響，確定最適初始pH。

(2)種齡的影響：分別將不同菌齡(48、56、64、72、80 h)的種子液接種到發(fā)酵液中培養(yǎng)，確定最佳菌齡。

(3)接種量的影響：分別控制接種量為4%、8%、12%、16%、20%，研究最適接種量。

(4)發(fā)酵溫度的影響：將搖瓶分別置于25、30、35 ℃和變溫(28 ℃，2 d；26 ℃，2 d；25 ℃，2 d；23 ℃，數(shù)天)的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，確定適宜的發(fā)酵溫度。

(5)搖床轉(zhuǎn)速的影響：將搖瓶分別置于轉(zhuǎn)速為100、150、200、230 r/min的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，確定適宜的轉(zhuǎn)速。

(6)搖瓶裝液量的影響：在250 mL錐形瓶中分別裝25、50、75、100、125 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，研究不同裝液量對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響。

1.2.4 洛伐他汀的分離純化

1.2.4.1 紅曲中洛伐他汀提取分離路線

液態(tài)發(fā)酵液→洛伐他汀提取→離心→上清液濃縮→硅膠柱層析→洛伐他汀粗品→濃縮→LH20柱層析→收集→檢測(cè)純度[15-17]。

1.2.4.2 洛伐他汀提取

調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至堿性，于30 ℃、180 r/min的水浴搖床中提取1 h后，4 200 r/min離心5 min，取上清液。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀類(lèi)型的判定

采用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的洛伐他汀，色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵液中洛伐他汀的HPLC檢測(cè)色譜圖Fig.5 HPLC detection chromatogram of fermentation broth for the content of lovastatin

由圖5可知，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的洛伐他汀主要為開(kāi)環(huán)酸型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，天然紅曲產(chǎn)的洛伐他汀多為酸型，其藥效約為內(nèi)酯型的2倍[18]，因此紅曲霉洛伐他汀具有很好的藥用功效。

2.2 洛伐他汀液態(tài)發(fā)酵工藝研究

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1.1 碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

不同碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響如圖6所示，碳源為甘油時(shí)洛伐他汀產(chǎn)量最高(定義為100%)，確定最佳碳源為甘油。進(jìn)一步研究其不同添加量甘油對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響，從圖7可以看出，在3%時(shí)達(dá)到最大值(定義為100%)。

圖6 碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of carbon sources on lovastatin yield

圖7 甘油添加量對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of glycerol content on lovastatin yield

2.2.1.2 氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

不同氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響如圖8所示，黃豆粉效果最好(定義為100%)，確定為最佳氮源。進(jìn)一步對(duì)黃豆粉的最佳添加量進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9，添加量為2.5%時(shí)，洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最大(定義為100%)，所以確定黃豆粉的最適添加量為2.5%。

圖8 氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of nitrogen sources on lovastatin yield

圖9 黃豆粉添加量對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of soybean powder content on lovastatin yield

2.2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響如圖10所示，其中ZnSO4·7H2O最高(定義為100%)，ZnSO4·7H2O和KH2PO4的洛伐他汀產(chǎn)量比較接近，所以選擇KH2PO4和ZnSO4·7H2O兩種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)機(jī)鹽添加量為兩種無(wú)機(jī)鹽添加量的總和，其中ZnSO4·7H2O和KH2PO4的添加量按照2∶1的配比來(lái)添加。不同無(wú)機(jī)鹽添加量時(shí)洛伐他汀產(chǎn)量如圖11所示，當(dāng)添加量為0.05%時(shí)，洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最高(定義為100%)，可推測(cè)少量的無(wú)機(jī)鹽可對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)量造成顯著影響，量太多反而抑制洛伐他汀的合成。確定最佳無(wú)機(jī)鹽添加量為0.05%。

圖10 無(wú)機(jī)鹽對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of inorganic salts on lovastatin yield

圖11 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of inorganic salt content on lovastatin yield

2.2.1.4 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽最佳配比的正交試驗(yàn)

選擇甘油、黃豆粉、KH2PO4和ZnSO4·7H2O四個(gè) 因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34) orthogonal expertments

根據(jù)上表極差R可知，影響洛伐他汀產(chǎn)量的因素主次順序?yàn)锽>C>A>D，最優(yōu)組合為B1C3A2D2，即甘油3%、黃豆粉2%、ZnSO4·7H2O 0.47%、KH2PO40.017%。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)組合中A、D因素添加量不變的基礎(chǔ)上，降低因素B兩個(gè)水平，升高因素C兩個(gè)水平，得到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，再取最優(yōu)組合B1C3A2D2和正交試驗(yàn)中產(chǎn)量最高的第7組(見(jiàn)表2)為參考組，組成6組組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表 單位：%Table 3 Analysis of test results

實(shí)驗(yàn)組3的洛伐他汀產(chǎn)量最高，但因硫酸鎂對(duì)洛伐他汀合成也有一定的促進(jìn)作用(見(jiàn)圖10)，故在實(shí)驗(yàn)組3的基礎(chǔ)上添加不同量的硫酸鎂，進(jìn)一步研究其對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 硫酸鎂添加量對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.12 Effect of MgSO4·7H2O content on lovastatin yield

由圖12可知，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.15%時(shí)，洛伐他汀產(chǎn)量最高(定義為100%)，所以確定紅曲霉R”-30液態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為：甘油3%，黃豆粉1.5%，ZnSO4·7H2O 0.66%，KH2PO40.017%，MgSO4·7H2O 0.15%。

2.2.2 液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)幾個(gè)主要發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖13)表明，發(fā)酵液最佳初始pH為5，最適接種齡為64 h，最佳接種量為8%；恒溫培養(yǎng)的效果優(yōu)于變溫培養(yǎng)，且發(fā)現(xiàn)30～35 ℃洛伐他汀產(chǎn)量相對(duì)較高，故選擇30 ℃恒溫培養(yǎng)的方式取代變溫培養(yǎng)；最適轉(zhuǎn)速為150 r/min，最佳裝液量為50 mL/250 mL。

a-培養(yǎng)基初始pH值的影響; b-菌齡的影響; c-接種量的影響;d-溫度的影響，V-T:變溫; e-搖床轉(zhuǎn)速的影響; f-裝液量的影響圖13 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化Fig.13 Optimization of fermentation conditions in shake flask

2.3 紅曲菌株R”-30液態(tài)發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量測(cè)定

將菌株R”-30接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)，從第4天開(kāi)始，每隔24 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量，繪制洛伐他汀產(chǎn)量隨發(fā)酵周期的變化曲線(圖14)。

圖14 菌株R”-30洛伐他汀產(chǎn)量與發(fā)酵周期的關(guān)系曲線Fig.14 The relationship curve of R”-30 lovastatin production and fermentation period

洛伐他汀產(chǎn)量于第10天開(kāi)始趨于平穩(wěn)，第12天達(dá)到最大值，此時(shí)洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到615.3 mg/L；與優(yōu)化前相比，洛伐他汀產(chǎn)量由312 mg/L提高到615.3 mg/L，提高了97.2%。發(fā)酵周期沒(méi)有改變，還是于第12天達(dá)到最大值。

2.4 發(fā)酵液中洛伐他汀的分離純化

2.4.1 洛伐他汀提取工藝優(yōu)化

洛伐他汀在發(fā)酵液中以洛伐他汀羧酸的形式存在，主要存在于菌絲體內(nèi)。以NaOH(6 mol/L)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至堿性，將洛伐他汀轉(zhuǎn)化為洛伐他汀酸鈉并溶于發(fā)酵液中[19]。測(cè)定不同pH(9～12.5)對(duì)洛伐他汀溶出率的影響，以加70%乙醇，料液比1∶9，55 ℃，130 r/min萃取1 h的溶出率作對(duì)照，結(jié)果如圖15所示。

圖15 不同pH下洛伐他汀的溶出率Fig.15 The dissolved quantity of lovastatin at different pH

當(dāng)調(diào)發(fā)酵液pH為11時(shí)，洛伐他汀的溶出率相對(duì)較高，而pH超過(guò)12.5時(shí)，溶出率急劇下降，可能是強(qiáng)堿條件破壞了洛伐他汀的結(jié)構(gòu)，從而檢測(cè)不出。故確定pH 11為最佳溶出pH。

2.4.2 硅膠柱洗脫

取適量硅膠(200目)用A溶劑浸泡后濕法裝柱，柱子直徑9 mm，裝柱高度約12～13 cm。上樣量0.5 mL，上樣后先加14～15 mL A溶劑進(jìn)行洗脫，再加20 mL B溶劑洗脫，最后加8 mL C溶劑洗脫，控制流速在1～2滴/s。收集各洗脫液，檢測(cè)洛伐他汀主要分布在哪種溶劑及其純度。

選擇不同極性的有機(jī)溶劑，按極性從小到大列出3種洗脫方式，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同洗脫方式及結(jié)果Table 4 Different elution methods and results

由上表可知方式2得到的洛伐他汀粗品純度較高，故選擇方式2作為硅膠柱層析的洗脫方式，收集B洗脫液濃縮。

2.4.3 LH20柱層析

取Sephadex LH20用60%乙醇浸泡后濕法裝柱，柱子直徑9 mm，裝柱高度4～5 cm，取洛伐他汀粗品濃縮液0.5 mL上樣。上樣后，先加5 mL超純水進(jìn)行洗脫，再加5 mL 20%甲醇洗脫，最后加5 mL 50% 甲醇洗脫，控制流速在1～2滴/s。收集各個(gè)洗脫液，檢測(cè)洛伐他汀在各個(gè)溶劑中的含量及其純度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同洗脫液中洛伐他汀含量及純度Table 5 Lovastatin content and purity in different elution liquid

洛伐他汀主要集中在20%甲醇洗脫液中，采用HPLC檢測(cè)純度，純度達(dá)93%，色譜圖見(jiàn)圖16。收集5 mL 20%甲醇洗脫液，適當(dāng)濃縮后得到純化的洛伐他汀溶解液。

a-發(fā)酵液中洛伐他汀色譜圖； b-分離純化后洛伐他汀色譜圖圖16 洛伐他汀HPLC圖譜Fig.16 HPLC chromatogram of lovastatin

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)LH20柱層析分離后，洛伐他汀純度可達(dá)93%，得率45%；可見(jiàn)硅膠柱和LH20柱層析可有效去除雜質(zhì)，獲得高純度的洛伐他汀。

3 結(jié)論

對(duì)紅曲霉R”-30液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件為：甘油30 g/L，黃豆粉15 g/L，ZnSO4·7H2O 6.6 g/L，KH2PO40.17 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH 5.0，裝液量50 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)，種子液培養(yǎng)64 h，接種量8%(體積分?jǐn)?shù))。

對(duì)紅曲霉R”-30液態(tài)發(fā)酵過(guò)程洛伐他汀產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，洛伐他汀產(chǎn)量于第12天達(dá)到最大值，為615.3 mg/L，比優(yōu)化前(312 mg/L)，提高了97.2%。紅曲霉液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的洛伐他汀主要為開(kāi)環(huán)酸型。

對(duì)紅曲霉R”-30液態(tài)發(fā)酵液中洛伐他汀進(jìn)行分離純化。發(fā)酵液先用6 mol/L NaOH溶液堿提，離心取上清；再通過(guò)硅膠柱和Sephadex LH20柱層析，經(jīng)HPLC檢測(cè)，洛伐他汀純度達(dá)93%，得率為45%。