龍牙楤木總皂苷對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

孫麗 宋欣麗 于夢(mèng) 文超 魯衛(wèi)星

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全世界冠心病發(fā)生和死亡的主要原因[1]，而且近年來呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，通過藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈搭橋等方法使冠狀動(dòng)脈盡快恢復(fù)血供是目前最常用的治療方法，也是降低急性心梗死亡率的主要措施。然而在復(fù)灌過程中心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步損傷，甚至比缺血時(shí)更為嚴(yán)重，這種現(xiàn)象即為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2-3]。研究結(jié)果表明，再灌注過程中NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein3，NLRP3)炎癥小體的表達(dá)量增加，且抑制NLRP3炎癥小體后可以減輕心肌損傷、改善心臟功能[4-5]。

龍牙楤木為五加科植物，主要分布在中國(guó)東北地區(qū)，其根莖皮均可入藥，味辛性平，具有益氣活血、祛風(fēng)除濕、安神止痛之功。研究表明，龍牙楤木總皂苷具有明顯的抗心肌缺血再灌注損傷的作用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察心率(heart rate，HR)、左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtMax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtMax)變化，灌流液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、心肌病理改變等探討龍牙楤木總皂苷是否通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮改善心肌缺血再灌注過程中心功能的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠48只，購(gòu)于北京市維通利華，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。體重250～300 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)三天，隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、龍牙組、MCC950組(陽藥組)，每組12只。

1.2 藥品和試劑

龍牙楤木總皂苷由吉林中醫(yī)藥研究所提供；肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Merck公司)；NLRP3炎癥小體特異性抑制劑MCC950(美國(guó)MCE公司)；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；余分析純?cè)噭?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器

Langendorff System(澳大利亞 AD Instruments Pty Ltd實(shí)驗(yàn)室)、恒溫水浴(LETIC公司)、蠕動(dòng)泵(Gilson公司)、壓力傳感器(澳大利亞 AD Instruments)、MP150多導(dǎo)聯(lián)生理儀(美國(guó)Biopac)、PH儀(上海盛磁儀器有限公司)、醫(yī)用二元?dú)?95%O2+5%CO2)、5/0帶線縫合針(上海醫(yī)用縫合針廠有限公司)、硬膜外麻醉導(dǎo)管(廣州金導(dǎo)醫(yī)療科技有限公司)、安全套(岡本珠式會(huì)社)。

1.4 改良Krebs-Henseleit(K-H)灌流液的配置

分別稱取NaCl 6.90 g、NaHCO32.19 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、MgSO40.14 g、CaCl20.14 g、C6H12O62.0 g，將除CaCl2以外的其他成分混勻至液體澄清，再加入CaCl2溶液攪拌均勻，用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7.35～7.45之間，定容到1 L。

1.5 Langendorff離體心臟灌流模型制備

將大鼠稱重，按1×103u/kg腹腔注射肝素鈉，充分肝素化后按1 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥麻醉。固定動(dòng)物，開胸暴露主動(dòng)脈弓，眼科鑷夾緊主動(dòng)脈弓分支前，剪斷主動(dòng)脈，將取下的心臟放入0℃的K-H液中。提著主動(dòng)脈斷端插入Langendorff灌流套管中，并以0號(hào)線固定心臟。將恒溫水浴預(yù)先設(shè)置到38℃，用含有95%O2和5%CO2的K-H液進(jìn)行恒流灌注(10 mL/分鐘)。剪開右心耳流出灌流液，待心臟正常搏動(dòng)后，使用5/0帶線縫合針在左心耳下方2 mm穿線。破開左心耳，將自制心室內(nèi)壓球囊放入左心室，壓力感受器連接多導(dǎo)生理儀，記錄心臟電生理活動(dòng)，心臟功能穩(wěn)定后，平衡20分鐘。入組標(biāo)準(zhǔn)：心律齊，心率≥220次/分鐘，左室收縮壓≥60 mmHg[9]。假手術(shù)組：只穿線不結(jié)扎，以改良的K-H液持續(xù)平衡灌流105分鐘；模型組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處30分鐘，K-H液復(fù)灌75分鐘；龍牙組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處30分鐘，以含5 mg/L龍牙楤木總皂苷的K-H液復(fù)灌75分鐘；MCC950組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處30分鐘，以含15 umol/L MCC950的K-H液復(fù)灌75分鐘。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-tripheny ltetrazolium chloride,TTC)染色 灌流結(jié)束后，取下心臟，去除多余組織，用吸水紙吸干心臟表面的水分，置于-20℃冰箱中存放20分鐘，然后將心臟從心尖至心底部平均切成6片(厚約2 mm)，將切片置于1%TTC溶液，38℃避光孵育染色30分鐘，后放入4%多聚甲醛中固定24小時(shí)。染色后正常心肌為紅色，梗死心肌為灰白色。

1.6.2 血流動(dòng)力學(xué) 采用Biopac MP150多導(dǎo)生理儀記錄全程心率(HR)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtMax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtMax)。

1.6.3 灌流液中CK、LDH、MDA、SOD的含量 收集平衡20分鐘、再灌注15分鐘、再灌注75分鐘的灌流液，-20℃保存?zhèn)溆?。?biāo)本收集后按照試劑盒說明測(cè)定其含量。

1.6.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 灌流結(jié)束后，取下心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片(厚約4 μm)，切片脫蠟至水，放入蘇木素染10分鐘，自來水沖洗，后放入伊紅染液中染色2分鐘，脫水封片，光鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血再灌注模型的鑒定

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠再灌注時(shí)出現(xiàn)心律失常、心肌收縮和舒張功能下降，見圖1；模型組TTC染色顯示灰白色梗死區(qū)，提示模型構(gòu)建成功，見圖2。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)影響

各組間平衡20分鐘、局部缺血30分鐘、再灌注15分鐘、再灌注75分鐘心率平穩(wěn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。平衡20分鐘，各組間LVDP、±dp/dtMax差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；缺血30分鐘，模型組、龍牙組、MCC950組LVDP、±dp/dtMax明顯下降(P>0.05)，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注15分鐘，龍牙組LVDP、±dp/dtMax明顯上升，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與假手術(shù)組、MCC950組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；再灌注75分鐘，各組LVDP、±dp/dtMax有所下降，龍牙組與假手術(shù)組、MCC950組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 心臟組織病理學(xué)改變

心臟組織HE染色顯示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)完整，排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大量心肌細(xì)胞出現(xiàn)溶解、破碎，心肌纖維斷裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，MCC950組、龍牙組病理改變顯著改善。見圖3。

2.4 灌流液中CK、LDH的含量

假手術(shù)組平衡20分鐘、再灌注15分鐘、再灌注75分鐘灌流液中CK、LDH穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；平衡20分鐘，各組間灌流液中CK、LDH穩(wěn)定(P>0.05)；再灌注15分鐘，模型組、龍牙組、MCC950組灌流液中CK、LDH明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，龍牙組、MCC950組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與MCC950組比較，龍牙組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；再灌注75分鐘，與模型組比較，龍牙組、MCC950組灌流液中CK、LDH下降(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，龍牙組、MCC950組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與MCC950組比較，龍牙組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖1 假手術(shù)組、模型組大鼠再灌注時(shí)血流動(dòng)力學(xué)改變

圖2 模型組大鼠心肌TTC染色結(jié)果

表1 各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)比較

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

注：A:假手術(shù)組；B:模型組；C:MCC950組；D:龍牙組

圖3各組大鼠心臟組織病理學(xué)改變(HE×400)

表2 各組大鼠灌流中CK、LDH、MDA、SOD含量比較

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.5 灌流液中MDA、SOD的含量

平衡20分鐘；各組間灌流液中MDA、SOD穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；再灌注15分鐘，龍牙組、MCC950組灌流液中MDA含量較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，再灌注75分鐘時(shí)同樣低于模型組(P<0.05)，龍牙組與MCC950組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，再灌注15分鐘及75分鐘時(shí)龍牙組、MCC950組灌流液中SOD含量較模型組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與過度氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，龍牙楤木總皂苷可以減少氧自由基等有害物質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞膜的損傷使心肌酶的溢出減少，增加SOD活性，降低MDA含量，從而升高缺血再灌注過程中LVDP、±dp/dtMax，促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)，且并無呈現(xiàn)再灌注時(shí)間依賴性。

龍牙楤木總皂苷是龍牙楤木中研究最多的活性成分，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗心肌缺血、抗腫瘤、抗炎、降血糖、保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[11-12]。本課題組一直致力于龍牙楤木總皂苷抗心肌缺血再灌注方面的機(jī)制研究，目前發(fā)現(xiàn)龍牙楤木總皂苷通過抗氧化、降低CD40L表達(dá)、開放線粒體ATP敏感性鉀通道等發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，龍牙楤木總皂苷能夠提高心肌缺血再灌注損傷后大鼠心臟LVDP、±dp/dtMax，顯著降低灌流液中心肌酶CK、LDH的含量、增加SOD活性、降低MDA含量、減少心肌細(xì)胞破碎、心肌纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示龍牙楤木總皂苷可直接改善心臟功能，其機(jī)制可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活，減少炎癥反應(yīng)及心肌酶的釋放從而保護(hù)心肌。