UPLC-MS/MS測(cè)定豬肉中4種氟喹諾酮?dú)埩袅康牟淮_定度評(píng)價(jià)

虞冰，劉莉，馬婧妤，吾建祥，楊德毅，刁銀軍

(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測(cè)中心，浙江 金華 321017；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是一類全合成廣譜抗菌藥，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病預(yù)防與治療[1-2]。FQs可通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成不良影響。FQs在動(dòng)物體內(nèi)的殘留問題已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注，很多國(guó)家和組織將FQs列入限制使用名單中，并制訂最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)[3-5]。

測(cè)量不確定度是判定檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)的根本，同時(shí)也體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室評(píng)定檢測(cè)和校準(zhǔn)水平?！缎?zhǔn)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室能力的通用性要求》明確要求，“當(dāng)不確定度與檢測(cè)結(jié)果的有效性或應(yīng)用有關(guān)，或客戶的指令中有要求，或不確定度影響到限度的符合性時(shí)，檢測(cè)報(bào)告中需包括有關(guān)不確定度的信息”。根據(jù)《中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范》《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》等要求，檢測(cè)機(jī)構(gòu)在食品安全性指標(biāo)檢測(cè)中需對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)估。本文根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范技術(shù)要求及化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定金華兩頭烏豬肉中4種氟喹諾酮?dú)埩袅康姆椒ǎ?duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)及分析，為金華兩頭烏豬肉品質(zhì)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

金華兩頭烏豬肉購(gòu)自金華市兩頭烏養(yǎng)殖基地；依諾沙星(純度為99.3%)、氧氟沙星(純度為99.30%)、諾氟沙星(純度為99.10%)、培氟沙星(純度為99.00%)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自北京振翔科技有限公司；無水硫酸鈉、正己烷均為分析純；乙腈、甲酸為色譜純。

LC-MS/MS8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；CF6RN高速離心機(jī)，日本Hitachi公司；BSA2202S電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；T25渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；N-EVAP氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；HY-4調(diào)速多用振蕩器，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星各10.00 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容溶解，各吸取1 mL至25 mL容量瓶中，配制成40 μg·mL-1氟喹諾酮類獸藥混和標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，倍比稀釋至100 ng·mL-1氟喹諾酮類混標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取已勻漿兩頭烏豬肉樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，振蕩1 min，再加入4 mL酸化的乙腈(乙腈∶甲酸99∶1)溶液，渦旋混勻，超聲3 min，4 ℃、4 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用4 mL酸化乙腈重復(fù)提取1次，提取液合并至離心管中定容。提取液中加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，振蕩5 min，棄去上層正己烷，重復(fù)凈化1次，氮?dú)獯蹈珊?，加? mL乙腈溶解，加入1 mL水，超聲30 s，渦旋混勻，取1 mL定容液，4 ℃、14 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 UPLC-MS/MS分析

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS柱，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A：0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈/甲醇溶液(6∶4)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 超高效液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI(+)；源溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；加熱氣：空氣，流速10.0 L·min-1；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣：氮?dú)?，流?.0 L·min-1；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣：氮?dú)猓魉?0.0 L·min-1；延遲時(shí)間：3 ms；碰撞氣：氬氣。氟喹諾酮類獸藥檢測(cè)離子對(duì)、碰撞能參數(shù)見表2。

表2 4種氟喹諾酮類獸藥定性定量離子參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 建立不確定度數(shù)學(xué)模型

配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定樣品溶液的濃度，建立測(cè)定樣品中喹諾酮類藥物殘留量的數(shù)學(xué)模型：

X=1 000cV/(1 000×m)。

(1)

式中：X指樣品中待測(cè)組分的含量(μg·kg-1)，c指測(cè)定液中待測(cè)組分的濃度(ng·mL-1)，V指定容體積(mL)，m指樣品稱樣量(g)。

2.2 不確定度的主要來源

不確定度來源主要包括標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線引入的不確定度、樣品測(cè)定引入的不確定度3大類(圖1)。

圖1 UPLC-MS/MS測(cè)定氟喹諾酮?dú)埩袅康牟淮_定度來源

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度urel(p)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度urel(p1)

c指氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品的純度，標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)不確定度計(jì)算公式為：

(2)

稱取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，根據(jù)JJG 1306—2008《電子天平檢定規(guī)程》，天平允許的最大誤差為±0.05 mg，準(zhǔn)確稱取氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.00 mg，按均勻分布，稱量引入的相對(duì)不確定度為：

(3)

式中，m為標(biāo)準(zhǔn)品的稱量質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度urel(p2)

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，10 mL容量瓶(A)級(jí)容量允差為±0.02 mL，按照均勻分布；同時(shí)，20 ℃時(shí)甲醇的熱膨脹系數(shù)為0.001 2，假設(shè)室溫偏差控制在±5 ℃，按照均勻分布。經(jīng)計(jì)算，氟喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度urel(p2)為0.115 6。

合成標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度urel(p1)和標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度urel(p2)，氟喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度urel(p)見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

2.4 標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線引入的不確定度urel(s)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度urel(s1)

使用A級(jí)吸量管分別準(zhǔn)確吸取2、5、8、10、20、50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于A級(jí)100 mL單標(biāo)容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度線，所得濃度依次為2、5、8、10、20、50 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，A級(jí)100 mL單標(biāo)容量瓶容量允差為±0.1 mL，A級(jí)10 mL吸量管的容量允差為±0.02 mL，按照均勻分布。20 ℃時(shí)甲醇的熱膨脹系數(shù)為0.001 2，假設(shè)室溫偏差控制在±5 ℃，按照均勻分布。氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制過程中引入的不確定度見表5，經(jīng)合成，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制引入的不確定度urel(s1)為0.007 02。

表5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制過程引入的不確定度

2.4.2 擬合曲線引入的不確定度urel(s2)

取以上對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 ng·mL-1的6種標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1 μL分別測(cè)定，得到相應(yīng)的色譜峰面積Ai，用Excel擬合而成的線性回歸方程為Ai=aCi+b。式中，a為斜率，b為截距。根據(jù)公式：

(4)

式中，SR指標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，p指試樣平行測(cè)量次數(shù)，n指擬合曲線的數(shù)據(jù)總數(shù)，C平指標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，C0指待測(cè)樣品溶液按回歸方程計(jì)算得到的濃度平均值。

SR計(jì)算方法為：

(5)

式中，n為測(cè)定次數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)中，擬合曲線的數(shù)據(jù)總數(shù)n=6，樣品測(cè)定次數(shù)p=3，經(jīng)合成，氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)溶液擬合曲線引入的不確定度見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合曲線引入的不確定度

2.5 樣品測(cè)定引入的不確定度urel(y)

2.5.1 樣品稱量引入的相對(duì)不確定度urel(y1)

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品，根據(jù)JJG 1306—2008《電子天平檢定規(guī)程》的要求，天平允許的最大誤差為±0.001 g，準(zhǔn)確稱取4種標(biāo)準(zhǔn)品，按均勻分布，樣品稱量引入的相對(duì)不確定度為urel(y1)=0.000 204。

2.5.2 儀器進(jìn)樣體積引入的相對(duì)不確定度urel(y2)

樣品上機(jī)進(jìn)樣量為1 μL，微量注射器體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為±1%，符合對(duì)稱分布，則儀器進(jìn)樣體積引入的相對(duì)不確定度urel(y2)=0.004 082。

2.5.3 樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)不確定度urel(y3)

金華兩頭烏豬肉陽(yáng)性樣品測(cè)定T1=10，陽(yáng)性樣品的不確定度計(jì)算公式為：

(6)

式中，r為陽(yáng)性樣品的平均值，Sr為標(biāo)準(zhǔn)偏差。陽(yáng)性樣品重復(fù)測(cè)量引入的相對(duì)不確定度見表7。

表7 陽(yáng)性樣品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度

2.5.4 樣品添加回收引入的相對(duì)不確定度urel(y4)

在空白豬肉試樣中添加20 μg·kg-1的4種氟喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定5次(T2)，根據(jù)平均回收率(z)，樣品添加回收引入的不確定度計(jì)算公式為：

(7)

式中，Srs為回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差。樣品添加回收引入的相對(duì)不確定度見表8。

表8 4種氟喹諾酮加標(biāo)回收引入的不確定度

綜上，樣品測(cè)定引入的不確定度urel(y)計(jì)算公式為：

(8)

根據(jù)公式，計(jì)算樣品測(cè)定引入的不確定度urel(y)(表9)。

表9 樣品測(cè)定引入的不確定度

2.6 合成不確定度urel

金華兩頭烏豬肉中4種氟喹諾酮藥物殘留量測(cè)定的合成不確定度計(jì)算：

(9)

經(jīng)計(jì)算，金華兩頭烏豬肉中氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星殘留量測(cè)定的合成不確定度urel分別為0.014 746 04、0.033 331 02、0.044 333 34、0.038 937 93。

2.7 擴(kuò)展不確定度u

對(duì)于大多數(shù)測(cè)量采用包含因子k=2衡量，則金華兩頭烏豬肉中氟喹諾酮含量的擴(kuò)展不確定度公式為：

u=urel×2×C。

(10)

式中C為陽(yáng)性樣品氟喹諾酮含量。

由此得到UPLC-MS/MS法測(cè)定中金華兩頭烏豬肉時(shí)，當(dāng)金華兩頭烏豬肉中氧氟沙星的含量為15.20 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.450 μg·kg-1，k=2；當(dāng)諾氟沙星的含量為19.32 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為1.291 μg·kg-1，k=2；當(dāng)培氟沙星的含量為9.34 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.829 μg·kg-1，k=2；當(dāng)依諾沙星的含量為16.34 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為1.275 μg·kg-1，k=2。

3 討論

在金華兩頭烏豬肉氟喹諾酮含量分析過程中，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品稱量、樣品檢測(cè)、加標(biāo)回收等過程均會(huì)引入不確定度，加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程中不確定度較大。為了減少金華兩頭烏豬肉中氟喹諾酮測(cè)定結(jié)果的誤差，可通過增加混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測(cè)定次數(shù)，增加平行樣品測(cè)定，保持氣相色譜儀器較高的靈敏度，并定期對(duì)所涉儀器進(jìn)行檢定和提高操作人員的熟練水平，來減小測(cè)量不確定度，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。