蘇海蘭，鄭梅霞，陳 宏，單寄坪，朱育菁

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2.福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司，福建 南平 354100)

重樓為我國瀕危珍稀中藥材，具有鎮(zhèn)痛、止血、抗炎和抗腫瘤等活性，是云南白藥和片仔癀等260多種中成藥的主要原料[1—4]。七葉一枝花(別名華重樓)(Paris polyphyllavar.chinensis)和云南重樓(別名滇重樓)(P.polyphyllavar.yunnanensis)是歷版《中國藥典》收載的2 種重樓基原藥材。近年來，福建、江西和浙江等南方低山丘陵區(qū)重樓種植面積不斷擴大，但存在藥材依賴采挖野生資源、缺乏主栽品種、引種云貴高原重樓種質(zhì)資源失敗等問題，同時，南方低山丘陵區(qū)相關重樓資源適應性評價尚未見有報道。黎華君等[5]對野生重樓資源的種類、分布情況及形態(tài)特征進行了歸納，對百宜野生重樓資源的保存和利用等提出了建議。尹鴻翔等[6]對川、滇地區(qū)重樓屬的資源、開發(fā)利用情況和瀕危狀態(tài)開展了實地調(diào)查，并依據(jù)《中國藥典》重樓藥材的質(zhì)控標準對該地區(qū)50 份重樓藥材進行質(zhì)量評價。蘇澤春[7]等采用TOPSIS 法與聚類分析法對23 份云南重樓資源的親緣關系進行綜合評價，其中有12 份云南重樓資源具有優(yōu)勢種源的特性，且在4 個聚類群中均有分布。對南方低山丘陵區(qū)重樓資源適應性的研究報道尚少，導致盲目引種和栽培不當?shù)痊F(xiàn)象時有發(fā)生，嚴重制約重樓種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文搜集全國各地120 份重樓資源，并統(tǒng)一栽植在福建省光澤縣，通過對其物候期、農(nóng)藝性狀和重樓皂苷含量等指標進行測定和分析，對在該地生長較好的七葉一枝花資源進行適應性評價，為篩選優(yōu)良品種和選擇適宜的種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重樓資源120 份，其中福建省67 份，云南省16 份、江西省9 份、四川省9 份、湖北5 份、湖南4 份、貴州省3 份、安徽省3 份、廣州2 份和河南省2 份(表1)。每份資源10～300 株，于2014 年栽植于福建省光澤縣承天重樓基地。海拔266 m，年平均氣溫17.6 ℃，平均降雨量1876.4 mm。供試土壤為砂質(zhì)壤土，土壤pH 5.1，有機質(zhì)29 g·kg-1，全氮0.146%，全磷0.43%，全鉀3.67%，土粒密度2.48 g·cm-3。

1.2 方法

1.2.1 資源鑒定

用形態(tài)學和分子標記技術鑒定方法對搜集的重樓資源進行鑒定。

1.2.2 物候期觀測

對120 份資源根據(jù)重樓植株的外部形態(tài)變化，記錄重樓從出苗至倒苗的時間，包括重樓出苗期、開花期、結果期和倒伏期。各物候期連續(xù)觀測2 年，若有資源第二年不出苗，則以第一年觀測數(shù)據(jù)為準。

出苗期：記錄20%資源出苗的日期，分析時折算成農(nóng)歷初一到出苗所需的天數(shù)；

開花期：從出苗期至20%植株開花所需的天數(shù)；

結果期：從出苗期至20%植株果實開始膨大所需的天數(shù)；

倒伏期：從出苗期至20%植株倒伏所需的天數(shù)。

1.2.3 七葉一枝花農(nóng)藝性狀測定和田間病害調(diào)查

選取第二年有出苗或長勢較好的資源，經(jīng)鑒定均為七葉一枝花，于7 月進行地上部農(nóng)藝性狀及田間病害觀測，11 月挖取相應的植株測量地下部性狀，每份資源調(diào)查5 株。農(nóng)藝性狀測定包括株高、莖粗、葉長、葉寬、葉片數(shù)量、葉柄長、根莖長、根莖直徑、根系長、刻痕數(shù)、根系鮮重和根莖鮮重。田間病害調(diào)查包括莖腐病、葉斑病和灰霉病，對發(fā)病情況進行統(tǒng)計并計算發(fā)病率。

1.2.4 七葉一枝花皂苷含量測定

根據(jù)2015 年版《中國藥典》方法，采用HPLC法對其中長勢較好的49 份七葉一枝花資源的重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅰ進行測定，并計算四種重樓皂苷的總含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 進行常規(guī)分析，采用DPS 18.10軟件進行統(tǒng)計分析，獲得最小值、最大值、平均值、標準差和變異系數(shù)，采用系統(tǒng)聚類法歐氏距離對各資源的特征數(shù)據(jù)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 重樓資源鑒定

120 份重樓資源的來源見表1，前期以形態(tài)學分類為基礎，并利用DNA 條形碼技術對搜集的重樓資源進行鑒定，結果發(fā)現(xiàn)有七葉一枝花、云南重樓、亮葉重樓(Paris nitida)、球藥隔重樓(P.fargesii)、凌云重樓(P.cronquistii)、毛重樓(P.mairei)、狹葉重樓(P.polyphyllavar.stenophylla)和北重樓(P.verticillata)。利用ITS2條形碼鑒別及遺傳變異位點分析，云南重樓長度范圍是457～665 bp，七葉一枝花序列長度范圍是457～663 bp；區(qū)分云南重樓和七葉一枝花的序列位點共計8 處；七葉一枝花樣本之間遺傳距離是0～0.004，云南重樓樣本之間的遺傳距離是0～0.054。ITS2序列的遺傳位點和聚類分化與品種有關，資源的地理位置越接近，其相對遺傳距離越小，說明不同地域環(huán)境是影響重樓遺傳序列變化的重要因素。

2.2 不同重樓資源在福建物候期表現(xiàn)

不同重樓資源在福建省光澤縣氣候條件下出苗、開花、結果及倒苗的物候期性狀差異顯著，各物候期性狀的變異系數(shù)分別為93.3%、47.8%、63.2%和18.1%，其中出苗期的變異系數(shù)最大；開花期和結果期的變異系數(shù)均超過35%；倒苗期的變異系數(shù)最小，但也超過15%。重樓資源間的出苗期最大相差3 個多月，廣東省資源出苗時間最早(2018 年2月1 日)，云南省資源出苗時間最晚(2018 年5 月13日)，福建本地資源一般于2018 年2 月上中旬出苗。

各資源物候期通過主成分分析(圖1)，結合聚類分析結果(表2)，可分成六類。第1 類群有82 個資源，占68.3%，2 月出苗，地上部植株年生長時間平均276 d，主要為福建、江西和廣東的重樓資源。第2 類群有31 個資源，占25.8%，4 月底至5 月中旬出苗，第一年地上部植株生長時間平均160 d，主要為云南、四川及貴州的重樓資源，花期與展葉期相近，果實基本上沒有膨大，即沒有完整的物候期。第3 類群有1 個資源，占0.8%，為湖北的重樓資源，地上部植株年生長時間最短(47 d)。第4 類群有3 個資源，占2.5%，為四川的重樓資源，4 月出苗，地上部植株年生長時間為58 d，病害發(fā)生較嚴重，地上部植株提前倒伏。第5 類群有1 個資源，占0.8%，為湖南的重樓資源，2 月出苗，地上部植株年生長時間僅82 d。第6 類群有2 個資源，占1.6%，為河南的重樓資源，4 月上旬出苗，地上部植株年生長時間平均233 d，有完整物候期。各地重樓資源在福建種植后，原產(chǎn)地海拔越高的資源出苗時間越晚。由于環(huán)境因素影響，云南、四川和貴州等地區(qū)的重樓資源在福建省種植的第一年有現(xiàn)蕾，但沒有果期；種植的第二年沒有現(xiàn)蕾，80%沒有出苗，20%的出苗期推遲至5 月1 日后，植株地上部8 月枯萎，重樓資源的營養(yǎng)生長和生殖生長狀態(tài)不良。與福建南平光澤基地同一緯度及地形地貌相似地區(qū)的重樓資源具有完整物候期。

表2 不同類型重樓資源物候期Table 2 Growth period indicators of different group of Rhizoma Paridis

主成分分析如表3 所示，4 個主要物候期中，前2 個特征根的累積貢獻率達88.480%，說明4 個主要物候期的絕大部分相關信息可由這前2 個主成分來概括。第1 主成分的特征值是2.684，貢獻率為67.106%，以出苗期的特征向量值最大，其次是開花期。說明出苗期對第1 主成分的影響最大，其次是開花期，因此將第1 主成分稱為物候期因子。增大第1 主成分值，可以使物候期增長。第1 主成分的結果期和倒伏期的特征向量為負值，說明倒伏期越早，物候期越短。第2 主成分的特征向量中，載荷較高的是倒伏期，故出苗期和倒伏期這2 種物候期可作為低山丘陵區(qū)域重樓資源的主要物候期。

圖1 重樓資源物候期主成分分析圖Fig.1 Principal component analysis of phenological periods of Rhizoma Paridis

表3 物候期相關矩陣的特征根、貢獻率及累計貢獻率Table 3 Characteristic root,contribution rate and cumulative contribution rate of the phenological phase correlation matrix

2.3 七葉一枝花不同種質(zhì)資源抗病性比較

120 份重樓資源中第二年長勢較好的有49 份七葉一枝花資源，對其田間葉斑病、莖腐病和灰霉病的發(fā)生情況進行調(diào)查。南方低山丘陵區(qū)域春夏季節(jié)多雨，七葉一枝花地上部植株的主要病害種類有葉斑病、莖腐病和灰霉病。七葉一枝花資源病害的變異系數(shù)如表4 所示，灰霉病的變異系數(shù)最大(250.1)，葉斑病和莖腐病的變異系數(shù)次之，但均超過50%，說明七葉一枝花資源病害變異豐富，可作為良種篩選的有效指標。

主成分分析如表5 所示，3 個主要病害前2 個特征根的累積貢獻率達77.038%，說明3 個主要病害的絕大部分相關信息可由這前2 個主成分來概括。第1 主成分的特征根是1.380，方差貢獻率為46.011%，以葉斑病的特征向量值最大，其次是灰霉病，兩者特征向量值相近，說明葉斑病和灰霉病對第1 主成分的影響大。第2 主成分的特征根是0.931，方差貢獻率為31.027%，以莖腐病的特征向量值最大，說明莖腐病對第2 主成分的影響最大。將第1和2 主成分稱為抗病性因子，增大第1 主成分值，可以增大七葉一枝花資源的抗病性。

表4 七葉一枝花資源病害發(fā)生情況及變異系數(shù)Table 4 The disease occurrence and its variation coefficient of Paris polyphylla var. chinensis resources

表5 七葉一枝花資源抗病性主成分分析Table 5 Analysis of principal component on disease resistance of Paris polyphylla var. chinensis resources

2.4 七葉一枝花資源不同農(nóng)藝性狀的相關性

移栽2 年后，80%重樓資源的果實為無效果，故沒有測定生殖性狀。七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關性如表6 所示。七葉一枝花資源的莖粗性狀比較特別，與株高、葉數(shù)、葉寬、葉柄長均為極顯著負相關，與根系重、根莖重和葉長亦為負相關，有待持續(xù)和大量觀測；地上部性狀均與根莖鮮重成正相關，根莖直徑和根系重量與根莖鮮重呈極顯著正相關；刻痕數(shù)與農(nóng)藝性狀均為正相關，刻痕數(shù)是反映重樓生長年限的一個指標，說明在一定范圍內(nèi)，生長年限越長，各指標值越大。該結果可用于指導生產(chǎn)。種植地土壤疏松和有機質(zhì)含量高有利于七葉一枝花根系生長，提高產(chǎn)量。

表6 七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關性Table 6 Correlation of agronomic traits of Paris polyphylla var. chinensis resources

七葉一枝花資源的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)如表7，不同資源的農(nóng)藝性狀有明顯的區(qū)域性差別。各個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小依次為根莖鮮重>根鮮重>葉柄長>株高>葉長>莖粗>根系長>葉寬>根莖長>根莖直徑>刻痕數(shù)>葉片數(shù)，根莖鮮重的變異系數(shù)最大，葉片數(shù)的變異系數(shù)最小。

表7 七葉一枝花不同種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)Table 7 Coefficients of variation of agronomic characteristics of different Paris polyphylla var.chinensis resources

主成分分析如表8 所示，12 個主要農(nóng)藝性狀前4 個特征根的累積貢獻率達80.080%，說明12 個主要農(nóng)藝性狀的相關信息可由前4 個主成分概括。第1 主成分的特征根是4.073，方差貢獻率為33.938%，株高的特征向量值最大，其次是葉寬，說明株高和葉寬對第1 主成分的影響大(表9)。第2 主成分的特征根是2.787，方差貢獻率為23.227%，根莖直徑的特征向量值最大，其次是根系長，說明根莖直徑和根系長對第2 主成分影響最大(表9)。第3 主成分的特征根是1.656，方差貢獻率為13.800%，根莖長的特征向量值最大，其次是葉數(shù)，說明根莖長和葉數(shù)對第3 主成分的影響最大(表9)。第4 主成分的特征根是1.094，方差貢獻率為9.115%，以刻痕的特征向量值最大，其次是葉長，說明刻痕和葉長對第4主成分的影響最大。第1、2、3 和4 主成分為產(chǎn)量因子，增大4 個主成分值，可以增加七葉一枝花資源的產(chǎn)量。

表8 七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關性主成分分析Table 8 Analysis of principal components of agronomic traits correlation of Paris polyphylla var. chinensis resources

表9 前4 個主成分對應的特征向量Table 9 The feature vector corresponding to the first 4 principal components

2.5 不同資源的七葉一枝花根莖有效成分變化

前期已測定第二年長勢較好的49 份七葉一枝花資源的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ以及4 種重樓皂苷的總含量，不同重樓資源的皂苷種類及含量沒有明顯的區(qū)域性區(qū)別，來自四川省峨眉山市、貴州省貴陽市花溪桐木嶺、福建省三明市泰寧縣大田鄉(xiāng)、福建省三明市建寧縣均口鎮(zhèn)、福建省三明市明溪縣蓋洋鎮(zhèn)、福建省龍巖市連城縣宣和鄉(xiāng)、福建省龍巖市長汀縣館前和福建省光澤縣寨里鎮(zhèn)8 處的資源可以檢出4 種重樓皂苷。符合2020 年版《中國藥典》重樓皂苷總含量的資源有27 份，占55%，資源編號分別是3、7、8、10～21、27、29、32、40～43、45～47、49、113。重樓皂苷Ⅶ、Ⅵ、Ⅱ和Ⅰ的變異系數(shù)分別為57.52%、246.82%、170.50%和296.83%，說明七葉一枝花資源根莖重樓皂苷含量變異豐富，選擇范圍較大(表10)。

表10 七葉一枝花資源根莖重樓皂苷含量變異系數(shù)Table 10 Coefficient of variation of Rhizoma Paridis saponin content

2.6 七葉一枝花適應性綜合評價

2.6.1 評分項目與計分標準

根據(jù)上述各性狀主成分分析和聚類分析結果，取物候期、抗病性、農(nóng)藝性狀、有效成分中對主成分影響較大的12 個性狀作為評價指標，每個指標分級計分如表11。

每份種質(zhì)資源的總得分越高則適應性越強，適宜推廣；反之則弱，不宜推廣種植。適應性分級如下：

1 級：總計評分≥54 分(共12 個指標，總分60分)，適應性較強，可直接大面積推廣。

2 級：總計評分介于48～53 分，適應性較強，可開發(fā)利用。

3 級：總計評分介于36～47 分，適應性中等，有些個別項目不符合標準，可根據(jù)其具體的特點，或采取一定措施，在適宜其生長的環(huán)境中應用。

4 級：總計評分<36 分，適應性較差，有較多指標都比較差，不適宜推廣。

2.6.2 綜合評分

根據(jù)本文建立的七葉一枝花適應性綜合評價標準，在福建種植期間，綜合評分大于50 分的資源有6 份，經(jīng)鑒定均為七葉一枝花(表12)。其中有4 份資源≥54 分，說明適應性較強，可根據(jù)具體情況直接利用。

表11 七葉一枝花資源適應性評價性狀指標及計分標準Table 11 Character index and scoring standard of adaptability evaluation for P.polyphylla var.chinensis resources

表12 綜合評分大于50 分的6 份資源Table 12 Six resources with comprehensive evaluation score greater than 50 points

3 討論

引種七葉一枝花栽培成功的判斷標準是在本地種植年限在2 年以上，可正常開花結果和越冬，即種群可以自然更新。相似經(jīng)緯度及地形地貌的資源才能夠正常生長，具有完整物候期。不同區(qū)域重樓資源在福建省種植時物候期和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)差異性最大，華南地區(qū)重樓資源2 月上旬開始出苗，植株地上部年生長時間為290 d 左右，有完整的物候期，農(nóng)藝性狀也能表現(xiàn)出資源在原產(chǎn)地的特性。云南、四川和貴州等地的重樓資源在福建省種植第二年有80%沒有出苗，20%的出苗期推遲到5 月1 日后，植株地上部長勢弱且過早枯萎，兩至三年后地下部根莖腐爛，全株死亡。經(jīng)多年實地調(diào)研及生產(chǎn)實踐摸索分析導致南方低山丘陵區(qū)域引種云貴川品種失敗的主要原因有：1)重樓資源對環(huán)境條件和種植技術要求較高；2)閩贛浙南方低山丘陵區(qū)域與云貴高原和四川盆地在地形、氣候和環(huán)境因子上差異較大，陳士林等[9]研究發(fā)現(xiàn)云南重樓的最大生態(tài)相似度區(qū)域主要包括云南、四川、貴州、湖北和湖南等??；3)閩贛浙夏季高溫多雨、春季低溫多雨和土壤有機質(zhì)少且黏性重等原因導致南方低山丘陵區(qū)域的重樓病蟲害較多，且病蟲害種類及發(fā)生規(guī)律、物候期和管理技術等方面與云貴川地區(qū)具有較大差異。

49 份資源的皂苷種類及含量差異較大，符合2020 年版《中國藥典》的重樓皂苷總含量有27份資源，占55%，有8 份資源含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ4 種重樓皂苷，其中46 份資源的偏諾皂苷總含有量占總皂苷比例的50%以上。陳鐵柱等[10]研究發(fā)現(xiàn)四川、湖北和廣西等21 個產(chǎn)地七葉一枝花中皂苷含量符合《中國藥典》的僅占14.3%，有18 個產(chǎn)地的七葉一枝花的偏諾皂苷總含有量占總皂苷比例的50%以上；李海濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)滇東南、滇南、滇西和滇中22 個產(chǎn)地的云南重樓中皂苷含量符合《中國藥典》的僅占27.3%；周愛存等[12]研究發(fā)現(xiàn)浙江省七葉一枝花的重樓皂苷含量符合《中國藥典》的低于50%。

七葉一枝花資源的病害(灰霉病、葉斑病和莖腐病)、農(nóng)藝性狀(根莖鮮重、根系鮮重和葉柄長)和重樓皂苷含量(重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ和Ⅵ)存在著廣泛的變異，變異系數(shù)均超過50%，說明七葉一枝花資源的這些指標變異豐富，可作為良種篩選的有效指標。各性狀主成分分析和聚類分析結果表明影響較大的4 項評價指標是物候期、抗病性、農(nóng)藝性狀和重樓皂苷含量，分別列出5 個評分等級(5、4、3、2、1 分)，每份種質(zhì)資源的總計得分越高，說明適應性越強，越適宜推廣。南方低山丘陵區(qū)域選擇七葉一枝花種質(zhì)資源時，應綜合考慮資源的生物學特性和自然條件(海拔、光照、濕度和土壤等)等，篩選獲得適宜當?shù)胤N植的優(yōu)質(zhì)七葉一枝花品種，培育道地藥材。