韓敏敏 李蜜 高程海 陳秋琪 陳春棣 鐘振國 易湘茜

摘要：【目的】研究海南西海岸真紅樹根際土壤細(xì)菌多樣性及延緩衰老活性和殺線蟲活性，挖掘更多潛在新物種和高效活性物質(zhì)，為紅樹林微生物資源的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳院Ｄ衔骱０?種真紅樹植物（紅海欖、桐花樹、白骨壤和紅樹）根際土壤為研究對(duì)象，采用9種分離培養(yǎng)基（AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、P3和P7），以稀釋涂布法和三線法從真紅樹根際土壤中分離細(xì)菌，通過菌株形態(tài)特征觀察及16S rRNA序列分析，探討真紅樹根際土壤細(xì)菌物種多樣性;利用秀麗隱桿線蟲活體模型對(duì)分離獲得的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物進(jìn)行延緩衰老活性篩選，并采用96孔板法測(cè)試細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的殺線蟲活性。【結(jié)果】經(jīng)排重合并及16S rRNA序列比對(duì)分析，從真紅樹根際土壤中分離得到23株根際細(xì)菌，隸屬于10目11科12屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）11株，占分離細(xì)菌總數(shù)的47.83%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。有2株細(xì)菌（IMDGX 6099和IMDGX 6198）的16S rRNA序列與有效發(fā)表菌株的相似性低于98.65%，可能為潛在新種。秀麗隱桿線蟲模型篩選發(fā)現(xiàn)3株細(xì)菌（IMDGX 6153、IMDGX 6098和IMDGX 6198）發(fā)酵液具有不同程度延緩線蟲衰老的活性，有1株細(xì)菌（IMDGX 6094）的發(fā)酵液對(duì)秀麗隱桿線蟲具有殺線蟲活性，其半數(shù)致死濃度（LC50）為192.02 μg/mL。【結(jié)論】海南西海岸真紅樹根際土壤細(xì)菌具有較高的物種多樣性，蘊(yùn)藏著豐富的細(xì)菌資源，且部分細(xì)菌菌株具有延緩衰老和殺線蟲活性，在新菌種、生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及研制新型抗衰老藥物和高效生物殺蟲劑方面均具有巨大潛力。

關(guān)鍵詞： 真紅樹植物;根際細(xì)菌;細(xì)菌多樣性;延緩衰老活性;殺線蟲活性

中圖分類號(hào)： S154.381? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）02-0327-08

Diversity and bioactivity of bacteria in rhizosphere soil of four true mangrove species on the west coast of Hainan

HAN Min-min， LI Mi， GAO Cheng-hai， CHEN Qiu-qi， CHEN Chun-di，

ZHONG Zhen-guo， YI Xiang-xi*

（Institute of Marine Drugs/Guangxi Scientific Research Center of Traditional Chinese Medicine，

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530200， China）

Abstract：【Objective】To study the bacterial diversity， anti-aging activity and nematocidal activities of rhizosphere soil of true mangrove in the west coast of Hainan， and to explore more potential new species and highly effective active substances， so as to provide reference for the development and application of mangrove microbial resources. 【Method】With the west coast of Hainan four true mangrove plants（Rhizophora stylosa， Avicennia marina， Avicennia marina and Rhizophora apiculata） rhizosphere soil as the research object， using nine kinds of isolation media（AGG， M4， M5， M7， M9， M10， M11， P3 and P7）， bacteria was isolated from true mangrove rhizosphere by dilute coating method and three line method. Through observing the strain morphological characteristics and 16s rRNA gene sequence analysis， the true mangrove rhizosphere bacteria species diversity was explored. The crude extracts from isolated bacterial fermentation products were screened for anti-aging activity by using Caenorhabditis elegans in vivo model， and the nematocidal activity of crude extracts from bacterial fermentation products was tested by 96-well plate method. 【Result】After sequencing， recombination and comparative analysis of 16S rRNA sequence， 23 strains of rhizosphere bacteria were isolated from the rhizosphere soil of mangrove trees， belonging to 10 orders， 11 families and 12 genera. Eleven strains of Bacillus sp. were dominant genus， accounting for 47.83% of the total number of isolated bacteria. Two strains （IMDGX 6099 and IMDGX 6198） had 16S rRNA sequences that shared less than 98.65% similarity with effective strains， which might be potential new species. Three strains of bacteria（IMDGX 6153， IMDGX 6098 and IMDGX 6198） were screened by C. elegans， their fermentation broth had nematicidal activity to various extents. The fermentation broth of one strain （IMDGX 6094） showed nematicidal activity， and its lethal concentration（LC50） was 192.02 μg/mL. 【Conclusion】The rhizosphere bacteria of true mangrove in the west coast of Hainan have high species diversity and rich microbial resources， and some bacterial strains have anti-aging and nematocidal activities. They have huge potential in the discovery of new species， and biological active substances and development of new anti-aging drugs and efficient biological pesticides.

Key words： true mangrove plants; rhizosphere bacteria; plants species diversity; anti-aging activity; nematocidal activity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41566004）; Development Program of High-level Talent Team under Qihuang Project of Guangxi University of Chinese Medicine（2018006）; Scientific Research Group Foundation of Institute of Marine Drugs， Guangxi University of Chinese Medicine（2018ZD005-A06）; Research Laun-ching Fund Project for Guangxi University of Chinese Medicine Introduced Doctors（2017BS039）

0 引言

【研究意義】2017年國家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的最新人口數(shù)據(jù)顯示，60周歲及以上老年人口比重為17.3%（殷勇，2019），預(yù)示著我國已進(jìn)入老齡化的快速發(fā)展階段。隨著全球人口老齡化趨勢(shì)日趨嚴(yán)重，衰老及衰老相關(guān)問題已成為世界各國共同面臨的緊要問題。結(jié)合當(dāng)前社會(huì)需求背景及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技手段，研制開發(fā)抗衰老藥物具有可觀的研究前景與價(jià)值。近年來，隨著環(huán)境綠化程度的不斷加深，植物病蟲害防治也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。植物病蟲害問題嚴(yán)重危害著我國乃至全世界農(nóng)作物，致使作物受到不同程度的侵害，最終導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕收。據(jù)報(bào)道，植物線蟲病對(duì)全球21種主要農(nóng)作物造成的損失每年可高達(dá)1000億美元（胡玉金等，2019）。世界范圍內(nèi)線蟲病害占植物病害的15%～20%，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)1570億美元（余威，2019）。因此，尋找新型高效的生物殺蟲劑已成為當(dāng)前植保領(lǐng)域的重要任務(wù)。1963年，英國科學(xué)家Brenner首次發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）成蟲是研究發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)理想的模型動(dòng)物（Brenner，1974）。秀麗隱桿線蟲因具有細(xì)胞數(shù)目少、全身通透、含有大多數(shù)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的成分分子、基因組序列測(cè)序完整、生命周期短和遺傳背景清晰等特點(diǎn)，已成為遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要模式材料（Greer et al.，2015;Koopman et al.，2016）。目前線蟲模型已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、抗衰老、抗腫瘤和抗菌藥物篩選，也常用于脂質(zhì)代謝糖尿病及慢性疲勞綜合癥等疾病的藥物篩選研究，發(fā)展前景十分廣闊;此外，由于線蟲在藥物篩選方面具有無需藥物誘導(dǎo)即可造模、能夠穩(wěn)定遺傳等優(yōu)勢(shì)，使線蟲模型逐漸成為藥物高通量篩選平臺(tái)（Kaletta and Hengartner，2006;許巧等，2015）。因此，以線蟲模型來模擬人類疾病是最簡單直接且有效的建模手段之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，我國科研人員從紅樹林植物中分離出放線菌和真菌資源，但相比之下對(duì)細(xì)菌的研究報(bào)道較少。劉慧杰等（2010）采用PCR-DGGE和DGGE指紋圖譜對(duì)福建省九龍江口紅樹林區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)及基因多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅樹林區(qū)細(xì)菌多樣性遠(yuǎn)大于非紅樹林區(qū)域。夏麗娟等（2014）從桐花、秋茄、白蓮、木欖和老鼠簕等5種真紅樹根際土壤中分離得到50株真菌，其中有16株真菌對(duì)多種球菌有抑菌活性，占總分離菌株的30.77%，且對(duì)金黃色葡萄球菌的拮抗率最高達(dá)32.00%。曹陽等（2018）從西門島紅樹林根系沉積物樣品中共分離到128株海洋細(xì)菌，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)31株能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs，占可培養(yǎng)海洋細(xì)菌總數(shù)的24%，均為變形菌門細(xì)菌。李小群等（2018）從廣西北侖河口紅樹林底泥中分離得到36株放線菌，有22株放線菌對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用，占所分離放線菌總數(shù)的61.11%。葉景靜等（2018）從8份紅樹林根際土壤樣品中共分離獲得88株放線菌，分屬于6目8科9屬，優(yōu)勢(shì)菌屬為小單孢菌屬和鏈霉菌屬;14株放線菌中，有7株具良好抗菌活性，陽性率為50.00%，其中4株分別對(duì)糞腸球菌或表皮球菌有一定抑制效果。【本研究切入點(diǎn)】海南西海岸紅樹林區(qū)是我國南海熱帶海岸特有的自然景觀，植物種類齊全，物質(zhì)積累豐富，加上獨(dú)特的熱帶雨林氣候，使其具有豐富的生物多樣性。但目前對(duì)該生境中細(xì)菌的多樣性研究報(bào)道較少，且在活性研究方面，尤其是針對(duì)延緩衰老和殺線蟲活性的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從海南西海岸紅樹林區(qū)采集4種真紅樹植物（紅海欖、桐花樹、白骨壤和紅樹）根際土壤樣品，對(duì)其根際細(xì)菌進(jìn)行分離并研究其多樣性，結(jié)合16S rRNA序列分析及生物模型篩選具有延緩衰老活性和殺線蟲活性菌株，為紅樹林微生物資源的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣品采集 供試真紅樹根際土壤樣品于2017年7月采集于海南西海岸海域。樣品采集方法：用取樣工具挖取表層5 cm左右的土壤，采用抖落法收集根際土壤，裝入作好標(biāo)記的取樣瓶中立即擰緊蓋子，置于采樣冰盒中24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品采集信息見?。

N2野生型秀麗隱桿線蟲（雌雄同體）和尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli OP50）均由廣西科學(xué)院汪斌博士惠贈(zèng)。

1. 1. 2 主要試劑及儀器設(shè)備 主要試劑：PCR引物及相關(guān)試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Chelex-100樹脂購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：Olympus SZX16體視鏡[奧林巴斯（北京）銷售服務(wù)有限公司]、SPH-200B振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、凝膠成像儀（美國BioRad公司）、Systerc VB-75滅菌鍋（日本Sanyo公司）、小型離心機(jī)（德國Sigma公司）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、B-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海沃瓏儀器有限公司）和PCR擴(kuò)增儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1. 1. 3 培養(yǎng)基 9種分離培養(yǎng)基分別為AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、P3和P7等;純化及保藏培養(yǎng)基為改良ISP2固體培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為改良ISP2液體培養(yǎng)基。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)菌分離純化 新鮮土壤樣品置于無菌平皿中，室溫下在超凈工作臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干后，用無菌研缽研磨成粉末狀。稱取2.0 g土壤樣品，將其倒入裝有20.0 mL無菌水的錐形瓶中，手動(dòng)搖勻;依次稀釋至10-3和10-4組織懸液，分別取組織懸液0.2 mL接種于9種分離培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～30 d，觀察菌落形態(tài)特征，挑選表面光滑的單菌落，使用改良ISP2培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，通過稀釋涂布法和三線法劃線純化，如有雜菌則進(jìn)行二次或多次純化，直至獲得純凈的單菌落，同時(shí)記錄菌落數(shù)及菌落形態(tài)特征。純化后的菌株制成20%（v/v）的菌懸液，采用甘油管冷藏法進(jìn)行保存。

1. 2. 2 PCR擴(kuò)增和16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

提取菌株DNA及16S rRNA序列測(cè)定，參照周雙清等（2010）Chelex-100 Resin法進(jìn)行菌株DNA提取，PCR擴(kuò)增參照Walsh等（1991）的方法。采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。條帶合格后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用DNA STAR處理，登陸數(shù)據(jù)庫EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）（Kim et al.，2009）進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，從中選取同源性最高典型菌株的16S rRNA序列作為參比對(duì)象。

1. 3 細(xì)菌菌株活性試驗(yàn)

1. 3. 1 粗提物制備 參考覃媚等（2016）的方法，將分離獲得的細(xì)菌菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后分別接種于200.0 mL ISP2液體培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d，離心收集發(fā)酵液，立即用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層減壓濃縮備用;收集粗提物，置于干燥器中低溫保存，用于延緩線蟲衰老活性的初步篩選及殺線蟲活性試驗(yàn)。

1. 3. 2 NGM（Nematode growth medium）培養(yǎng)基配制 參照Brenner（1974）的方法，1000.0 mL NGM培養(yǎng)基中含3.00 g NaCl、2.50 g蛋白胨、17.00 g瓊脂、25.0 mL K3PO4 緩沖液（含3.56 g K2HPO4、10.83 g KH2PO4，加水至100.0 mL）、975.0 mL蒸餾水，滅菌后加入抽濾除菌的5 mg/mL膽固醇溶液1.0 mL、1 mol/L? MgSO4 溶液1.0 mL和1 mol/L CaCl2 溶液1.0 mL。

1. 3. 3 線蟲培養(yǎng)方法 參照Brenner（1974）的方法，將線蟲挑至含E. coli OP50的NGM培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)（秀麗隱桿線蟲最佳生存溫度20～25 ℃，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)溫度一般設(shè)定為20 ℃的標(biāo)準(zhǔn)條件以保證線蟲正常生存）。線蟲同期化采用高氯酸鈉裂解法，即將正處于產(chǎn)卵期的雌雄同體線蟲用已滅菌、預(yù)冷的M9緩沖液清洗蟲體，從NGM培養(yǎng)基上沖洗至無菌的離心管中。向離心管中加入1∶3的裂解液，手動(dòng)搖勻混合3～5 min，于離心機(jī)中3000 r/min離心30～60 s，棄上清液收集沉淀。沉淀用已滅菌的M9溶液反復(fù)清洗2～3次，再轉(zhuǎn)至含E. coli OP50的NGM培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)48 h后即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1. 3. 4 延緩衰老活性試驗(yàn) 細(xì)菌粗提物樣品用1% DMSO溶液超聲波溶解制成500 μg/mL藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?。將培養(yǎng)好的L4期線蟲挑至加有50 μL藥液的NGM培養(yǎng)基中，以1% DMSO溶液為空白對(duì)照，生化培養(yǎng)箱中恒溫20 ℃培養(yǎng)，每組2板，每板20條線蟲，此時(shí)線蟲壽命天數(shù)記為0 d。此后，隔天對(duì)培養(yǎng)基中的線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，每天觀察并記錄線蟲生存、死亡及剔除的數(shù)量，將線蟲每2 d轉(zhuǎn)移至新的含藥液NGM培養(yǎng)基中，直至線蟲全部死亡。

1. 3. 5 殺線蟲活性試驗(yàn) 參照許敏等（2016）的方法，將同期化后的線蟲從培養(yǎng)基上洗下至1.5 mL EP管中，用M9緩沖液稀釋線蟲，使其濃度約1條/μL。在超凈工作臺(tái)上，將20 μL線蟲液加至96孔板中，再加入5 μL甲醇溶解的細(xì)菌發(fā)酵液粗提物（濃度為500 μg/mL），用M9緩沖液補(bǔ)足至100 μL后，20 ℃培養(yǎng)24 h后在體視顯微鏡下觀察并記錄線蟲總數(shù)和死亡數(shù)。另設(shè)1 μg/mL阿維菌素陽性組和5%甲醇溶液陰性對(duì)照組。

1. 3. 6 線蟲半數(shù)致死濃度（LC50）測(cè)定 將75 μL新鮮M9緩沖液加至96孔板中，同時(shí)加入20 μL線蟲液（1條/μL）。利用倍半稀釋法，將活性菌株（IMDGX 6094）的乙酸乙酯提取濃縮物用甲醇稀釋，使終濃度分別為1000、500、250和125 μg/mL，取5 μL置于96孔板中，置于20 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后在體視顯微鏡下觀察。蟲體僵直，振蕩30 s仍僵直判定為線蟲死亡，計(jì)算線蟲致死率，計(jì)算公式：線蟲致死率（%）=線蟲死亡數(shù)/線蟲總數(shù)×100，以線蟲致死率>50%為陽性結(jié)果。再以樣品濃度為橫坐標(biāo)、致死率為縱坐標(biāo)作圖，采用Probit法分別計(jì)算活性菌株的LC50。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

線蟲壽命數(shù)據(jù)及殺線蟲數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 5.0繪圖，利用DNASTAR整理細(xì)菌16S rRNA序列。

2 結(jié)果與分析

2. 1 真紅樹根際土壤細(xì)菌物種多樣性分析結(jié)果

采用9種分離培養(yǎng)基從真紅樹根際土壤中分離獲得49株細(xì)菌，根據(jù)16S rRNA序列對(duì)比排重，得到23株根際細(xì)菌，隸屬于2門4綱10目11科12屬，其中芽孢桿菌屬11株，占所分離細(xì)菌總數(shù)的47.83%，為優(yōu)勢(shì)菌屬（表2）。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA序列比對(duì)分析結(jié)果，菌株IMDGX 6099和IMDGX 6198與有效發(fā)表菌株B. hwajinpoensis SW-72T和S. rhizophila DSM 14405T的最高相似性分別為98.04%和98.32%，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA序列相似性低于98.65%的菌株屬于潛在新屬或新種的歸類原則（Kim et al.，2014），推測(cè)IMDGX 6099和IMDGX 6198可能為潛在新細(xì)菌物種。

2. 2 23株根際土壤細(xì)菌在不同土壤樣品及培養(yǎng)基中的分布情況

由表2和圖1可知，來源于不同土壤樣品的細(xì)菌種類和數(shù)量存在一定差異，其中，來源于紅海欖的1-14樣品分離獲得的細(xì)菌數(shù)量最多，共8株，包括蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和無色桿菌屬;1-3和2-3樣品均分離到芽孢桿菌屬，2-2樣品分離到不動(dòng)桿菌屬、泛菌屬、發(fā)光桿菌屬和Kushneria屬，1-4樣品分離到無色桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、泛菌屬、腐敗希瓦菌屬和Stakelama屬，7-7樣品分離到不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和發(fā)光桿菌屬;來源于桐花樹的2-1樣品中主要分離到芽孢桿菌屬的細(xì)菌，雖然分布種屬數(shù)量少，但分布廣泛。

由圖2可知，9種培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌數(shù)量差異較大，其中M7分離到的菌株最多，且菌屬最豐富，共有9個(gè)屬;其次是M11培養(yǎng)基，分離到4個(gè)屬;AGG、P3、P7、M4、M5、M9和M10培養(yǎng)基均分離到芽孢桿菌屬，且為優(yōu)勢(shì)菌屬。由此可見，M7培養(yǎng)基有利于真紅樹根際土壤細(xì)菌的分離純化，且分離到的細(xì)菌種類豐富，可作為紅樹林土壤細(xì)菌的首選分離培養(yǎng)基。

2. 3 細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物延緩線蟲衰老活性試驗(yàn)結(jié)果

以23株真紅樹植物根際土壤細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物為材料，秀麗隱桿線蟲經(jīng)典模型為對(duì)象篩選具有延緩線蟲衰老活性的菌株，結(jié)果（表3）顯示，菌株IMDGX 6153、IMDGX 6098和IMDGX 6198均具有不同程度的延長線蟲壽命作用;差異顯著性分析結(jié)果表明，菌株IMDGX 6198處理下線蟲的平均壽命與空白組相比差異顯著（P<0.05），而菌株IMDGX 6098和IMDGX 6153處理下線蟲的平均壽命與空白組相比達(dá)極顯著差異水平（P<0.01），菌株IMDGX 6098和IMDGX 6153延長線蟲壽命的程度高于菌株IMDGX 6198。其中，菌株IMDGX 6153是從桐花樹根際土壤中分離獲得，菌株IMDGX 6098和IMDGX 6198是從紅海欖根際土壤中分離獲得，說明紅海欖根際土壤是強(qiáng)活性微生物的高產(chǎn)環(huán)境。壽命是反映機(jī)體衰老的直接指標(biāo)之一（張麗梅，2018），經(jīng)對(duì)線蟲壽命周期分析可知，3株真紅樹根際土壤細(xì)菌均能延長線蟲壽命，活性菌株IMDGX 6153、IMDGX 6098和IMDGX 6198與空白組相比，其平均壽命分別提高27.49%、23.94%和10.54%，最大壽命分別提高36.36%、27.79%和13.87%。

2. 4 細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定結(jié)果

采用96孔板法對(duì)真紅樹植物根際土壤細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行殺線蟲活性測(cè)定，結(jié)果（表4）顯示，菌株IMDGX6094（P. guangzhouensis）發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)線蟲的致死率最高，為55.00%，LC50為192.02 μg/mL（圖3）;其余細(xì)菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)線蟲的致死率較低，均在35.00%以下。

3 討論

真紅樹植物生長在強(qiáng)輻射、高鹽、低氧、低光照、高壓及強(qiáng)還原性等特征的海岸潮間帶，為獨(dú)特的海洋微生物提供了巨大的生存空間（Takahashi and Omura，2003）。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)蘊(yùn)藏著豐富且極具特色的海洋微生物資源。據(jù)報(bào)道，自2007年以來已從紅樹林生境中分離和鑒定出66個(gè)新種和8個(gè)新屬（Jiang et al.，2018）?；谠撋鷳B(tài)系統(tǒng)資源豐富，紅樹林已成為新型生物活性代謝物的主產(chǎn)區(qū)（Jiang et al.，2015）。同時(shí)，該生態(tài)系統(tǒng)的特殊性造就了其植物根際土壤中微生物物種的多樣性，且富含大量已知和未知的新種屬微生物（Cheng et al.，2019），在新菌種、生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)生新藥藥效方面均具有巨大潛力。

本研究從海南西海岸真紅樹根際土壤中分離獲得2株疑似潛在新菌株，即來源于1-3、2-1和2-3樣品的IMDGX 6099（Bacillus sp.）和1-14樣品的IMDGX 6198（Stenotrophomonas sp.），其與有效發(fā)表菌株B. hwajinpoensis SW-72T和S. rhizophila DSM 14405T的16S rRNA序列相似性均低于98.65%。鑒于新物種發(fā)現(xiàn)生物活性的潛力相對(duì)較大，為此開展了延緩衰老活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1株細(xì)菌IMDGX 6198具有延緩線蟲衰老的活性，能在一定程度上延長線蟲平均壽命周期。Alavi等（2013）報(bào)道菌株S. rhizophilac DSM14405T具有促進(jìn)植物生長、保護(hù)根系免受生物脅迫和非生物脅迫的能力，在生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛力。Kumar和Manjunatha（2015）從油質(zhì)污染土壤堆肥中分離到Stenotrophomonas rhizophila （PM-1），經(jīng)檢測(cè)具有潛在的多環(huán)芳烴和原油利用能力;延緩衰老活性篩選結(jié)果顯示，有3株活性菌株均有不同程度的延長線蟲壽命周期的活性。本研究篩選出的活性菌株IMDGX 6198與有效發(fā)表菌株S. rhizophila DSM 14405T具有較高的序列相似性，該菌株能延長線蟲壽命周期，與Alavi等（2013）的研究結(jié)果一致。海南西海岸紅樹林土壤微生物兼具物種多樣性和生物活性多樣性，不僅豐富了延緩衰老活性菌株，還為挖掘新型活性物質(zhì)提供了研究依據(jù)。

在設(shè)計(jì)篩選殺蟲活性物質(zhì)策略上，早期活性初篩主要是利用小型活體動(dòng)物，是人們從微生物篩選殺蟲活性物質(zhì)常用的方法之一。結(jié)合從紅樹林生境發(fā)現(xiàn)細(xì)菌新物種和新型活性物質(zhì)的研究主要集中在土壤上（杜萍等，2014），以及有關(guān)海洋微生物菌株殺線活性的報(bào)道（陶玲等，2012;許敏等，2016），本研究初步探討了真紅樹根際土壤細(xì)菌的殺線蟲活性，發(fā)現(xiàn)IMDGX 6094（P. guangzhouensis）（類芽孢桿菌屬）具有殺線蟲活性，有望開發(fā)成一種對(duì)環(huán)境影響小、安全高效的殺線蟲劑。鑒于紅樹林土壤細(xì)菌的分布密度，結(jié)合近年來各紅樹林保護(hù)區(qū)細(xì)菌新物種、新活性化合物的發(fā)現(xiàn)及本研究中延緩線蟲衰老活性和殺線蟲活性篩選結(jié)果，可確定的是海南西海岸紅樹林植物根際土壤細(xì)菌物種多樣性豐富，但生物活性研究報(bào)道不多，尤其關(guān)于延緩衰老的活性鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)3株延緩線蟲衰老菌株，說明其代謝產(chǎn)物中可能包含新的化合物，從而賦予菌株延緩衰老的活性。但對(duì)于菌株延緩線蟲衰老的作用機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步開展相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證及深層次研究。

4 結(jié)論

采用9種分離培養(yǎng)基對(duì)海南西海岸紅樹林4種真紅樹植物根際土壤進(jìn)行細(xì)菌分離及鑒定，共分離獲得23株細(xì)菌，歸屬于2門4綱10目11科12個(gè)屬，并從中篩選出3株具有延緩衰老活性的細(xì)菌及1株殺線蟲細(xì)菌，表明真紅樹根際土壤中細(xì)菌種類豐富，且富含獨(dú)特的生物活性菌株，在新菌種、生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及研制新型抗衰老藥物和高效生物殺蟲劑方面均具有巨大潛力。

參考文獻(xiàn)：

曹陽，裘娟萍，余志良. 2018. 西門島紅樹林細(xì)菌種群及群體感應(yīng)細(xì)菌的分析[J]. 科技通報(bào)，34（10）：93-100. [Cao Y，Qiu J P，Yu Z L. 2018. Analysis of cultural bacterial po-pulation and quorum sensing bacteria in mangrove forest sediment at Ximen Island[J]. Bulletin of Science and Technology，34（10）：93-100.]

杜萍，劉晶晶，曾江寧，陳全震，朱旭宇，高瑜. 2014. 西門島紅樹林沉積物細(xì)菌分布與環(huán)境特征[J]. 海洋環(huán)境科學(xué)，33（5）：763-771. [Du P，Liu J J，Zeng J N，Chen Q Z，Zhu X Y，Gao Y. 2014. Bacteria distribution and environmental characteristics in the sediment of Ximen Island mangrove[J]. Marine Environmental Science，33（5）：763-771.]

胡玉金，馮敏，郭文秀，于毅. 2019. 作物根結(jié)線蟲病害綜合防治技術(shù)概述[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（4）：149-156. [Hu Y J，F(xiàn)eng M，Guo W X，Yu Y. 2019. Overview of integrated control techniques of root-knot nematode disease[J]. Shan-dong Agricultural Sciences，51（4）： 149-156.]

李小群，于清武，易湘茜，郝二偉，馬亮，顏棟美，高程海. 2018. 廣西北侖河口紅樹林底泥放線菌多樣性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（4）： 708-713. [Li X Q，Yu Q W，Yi X X，Hao E W，Ma L，Yan D M，Gao C H. 2018. Diversity of actinomycetes isolated from bottom mud of mangrove forest in Beilun Estuary of Guangxi and its antibacterial activity against Sporisorium scitamineum[J]. Journal of Southern Agriculture，49（4）： 708-713.]

劉慧杰，楊彩云，田蘊(yùn)，林光輝，鄭天凌. 2010. 基于PCR-DGGE技術(shù)的紅樹林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 微生物學(xué)報(bào)，50（7）： 923-930. [Liu H J，Yang C Y，Tian Y，Lin G H，Zheng T L. 2010. Analysis of microbial community structure in mangrove sediments by PCR-DGGE technique[J]. Acta Microbiologica Sinica，50（7）： 923-930.]

覃媚，于清武，竺利波，李菲，顏棟美，余煉，高程海. 2016. 三種江蘺共附生細(xì)菌多樣性及抑菌活性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（11）： 1966-1973. [Qin M，Yu Q W，Zhu L B，Li F，Yan D M，Yu L，Gao C H. 2016. Diversity of epiphytic bacteria of three species of Gracilaria and their bacteriostatic activities[J]. Journal of Southern Agriculture，47（11）： 1966-1973.]

陶玲，旭格拉·哈布丁，韓寧寧，余生艷，閆蕾蕾，欒迎春，劉少偉，郭琳，蔣忠科，余利巖，孫承航. 2012. 紅樹林植物內(nèi)生放線菌I07A-01824發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的分離、純化與鑒定[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)，7（1）： 5-8. [Tao L，Habden X，Han N N，Yu S Y，Yan L L，Luan Y C，Liu S W，Guo L，Jiang Z K，Yu L Y，Sun C H. 2012. Separation，purification and structural identification of an active nematicidal component from the fermentation broth of Endophytic streptomyces I07A-01824 from mangrove ecosystem[J]. Chinese Medicinal Biotechnology，7（1）： 5-8.]

夏麗娟，張焜，黃華容，張占生. 2014. 5種紅樹根際土壤真菌和內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（4）：259-263. [Xia L J，Zhang K，Huang H R，Zhang Z S. 2014. The antimicrobial activity of 5 kinds of mangrove fungi in rhizosphere soil and endophytic fungi[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（4）： 259-263.]

許敏，李靜，戴素娟，高春燕，劉佳萌，庹利，王飛飛，李小俊，劉少偉，蔣忠科，羅輝，張海濤，江黎明，孫承航. 2016. 廣東湛江紅樹林植物內(nèi)生放線菌資源勘探及生物活性研究[J]. 中國抗生素雜志，41（1）： 26-34. [Xu M，Li J，Dai S J，Gao C Y，Liu J M，Tuo L，Wang F F，Li X J，Liu S W，Jiang Z K，Luo H，Zhang H T，Jiang L M，Sun C H. 2016. Study on diversity and bioactivity of actinobacteria isolated from mangrove plants collected from Zhanjiang in Guangdong Province[J]. Chinese Journal of Antibiotics，41（1）： 26-34.]

許巧，許湘，王平. 2015. 福苓方對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，21（4）： 171-173. [Xu Q，Xu X，Wang P. 2015.Effect of fuling prescription on life-span of Caenorhabditis elegans[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，21（4）：171-173.]

葉景靜，鄭紅蕓，吳越，蔣蓮秀，陳建宏，黃庶識(shí)，黃大林. 2018. 廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志，13（11）： 1221-1226. [Ye J J，Zheng H Y，Wu Y，Jiang L X，Chen J H，Huang S S，Huang D L. 2018. Diversity and antimicro-bial activity of actinobacteria isolated frommangrover rhizosphere soil in the Maowei Sea of Guangxi[J]. Journal of Pathogen Biology，13（11）： 1221-1226.]

殷勇. 2019. 人口老齡化對(duì)東北亞地區(qū)經(jīng)濟(jì)的影響——中日韓比較[J]. 商業(yè)經(jīng)濟(jì)，（8）： 120-122. [Yin Y. 2019. The influence of aging population on the economy of northeast Asia—A comparison between China，Japan and South Korea[J]. Business & Economy，（8）： 120-122.]

余威. 2019. 農(nóng)作物栽培及病蟲害防治技術(shù)[J]. 農(nóng)家參謀，（16）：4. [Yu W. 2019. Techniques of crop cultivation and pest control [J]. The Farmers Consultant，（16）： 4.]

張麗梅. 2018. 紫山藥多糖抗衰老活性及其機(jī)制研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué).[Zhang L M. 2018. Effect of purple yam polysaccharides（PYPs） on anti-aging activity and its mechanism[D]. Beijing： China Agricultural University.]

周雙清，黃小龍，黃東益，胡新文，陳吉良. 2010. Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，24（2）： 123-125. [Zhou S Q，Huang X L，Huang D Y，Hu X W，Chen J L. 2010. A rapid method for Extracting DNA from actinomycetes by Chelex-100[J]. Biotechnology Bulletin，24（2）： 123-125.]

Alavi P，Starcher M R，Zachow C，Müller H，Berg G. 2013. Root-microbe systems： The effect and mode of interaction of stress agent（SPA）Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405T[J]. Frontiers in Plant Science，4：141.

Brenner S. 1974. The genetics of Ceanorhabditis elegans[J]. Genetics，77（1）： 71-94.

Cheng J，Xue L L，Zhu M，F(xiàn)eng J Y，Shen-Tu J，Xu J M，Brookes P C，Tang C X，He Y. 2019. Nitrate supply and sulfate-reducing suppression facilitate the removal of pentachlorophenol in a flooded mangrove soil[J]. Environmental Pollution，244： 792-800.

Greer E L，Blanco M A，Gu L，Sendinc E，Liu J Z，Aristiza-Corrales D，Hsu C H，Aravind L，He C，Shi Y. 2015. DNA methylation on N6-Adenine in C-elegans[J]. Cell，161（4）： 868-878.

Jiang Z K，Guo L，Chen C，Liu S W，Zhang L，Dai S J，He Q Y，You X F，Hu X X，Tuo L，Jiang W，Sun C H. Xiakemycin A. 2015. A novel pyranonaphthoquinone antibio-tic，produced by the Streptomyces sp. CC8-201 from the soil of a karst cave[J]. The Journal of Antibiotics，68（12）： 771-774.

Jiang Z K，Tuo L，Huang D L，Osterman I A，Tyurin A P，Liu S W，Lukyanov D A，Sergiev P V，Dontsova O A，Korshun V A，Li F N，Sun C H. 2018. Diversity，novelty，and antimicrobial activity of endophytic actinobacteria from mangrove plants in Beilun Estuary National Nature Reserve of Guangxi，China[J]. Frontiers in Microbiology，9： 868-879.

Kaletta T，Hengartner M O. 2006. Finding function in novel targets： C-elegans as a model organism[J]. Nature Reviews Drug Discovery，5（5）： 387-398.

Kim K H，Roh S W，Chang H W，Nam Y D，Yoon J H，Jeon C O，Oh H M，Bae J W. 2009. Nitratireductor basaltis sp. nov. isolated from black beach sand[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，59（1）： 135-138.

Kim M，Oh H S，Park S C，Chun J. 2014. Towards a taxono-mic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes[J]. International Journal of Systema-tic and Evolutionary Microbiology，64（2）： 346-351.

Koopman M，Michels H，Dancy B M，Kamble R，Mouchiroud L，Auwerx J，Nollen E A A，Houtkooper R H. 2016. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans[J]. Nature Protocols，11（10）：1798-1816.

Kumar S V P，Manjunatha B K. 2015. Studies on hydrocarbon degradation by the bacterial isolate Stenotrophomonas rhizophila（PM-1） from oil spilled regions of Western Ghats of Karnataka[J]. Science，Technology and Arts Research Journal，4（3）： 139.

Takahashi Y，Omura S. 2003. Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compoundsl[J]. Journal of General and Applied Microbiology，49（3）： 141.

Walsh P S，Metzger D A，Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J]. Biotechniques，10（4）： 506-513.