張振國，錢紅，劉克明，羅璋，尤宏爭，郝爽，李楠，馮守明

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221；2.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300400）

金鱒體色金黃，肉質(zhì)鮮美，具有一定的觀賞價值，1996 年黑龍江水產(chǎn)研究所從日本引進發(fā)眼卵，成功突破了金鱒親魚育成及人工繁育等技術[1]，現(xiàn)已成為我國鱒養(yǎng)殖的重要品種。金鱒屬于冷水性魚類，最適養(yǎng)殖水溫為12～18℃，主要在東北以及新疆、甘肅、青海等地養(yǎng)殖，北京山區(qū)也有較大規(guī)模的養(yǎng)殖。金鱒的抗病力較強，但隨著金鱒的養(yǎng)殖規(guī)模增加，養(yǎng)殖密度不斷提高，病害也頻繁發(fā)生，尤其是傳染性造血器官壞死病、弧菌病、細菌性鰓病、細菌性腎病、水霉病和小瓜蟲等疾病[2,3]。長期以來魚病防治主要還是使用抗生素和化學藥物，藥物殘留和食品安全問題日益嚴峻。目前免疫增強劑的研究應用較多，但多見于單一的種類，復合免疫制劑研究較少，僅有其對凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei[4]、刺參Apostichopus japonicus[5]、德國鏡鯉Cyprinus carpio specularis[6]以及大菱鲆Scophthalmus maximus和血鸚鵡Cichlasoma var.[7]的非特性免疫力的研究。

本實驗中使用的復合免疫增強劑主要成分是酵母多糖、大黃、黃芩、黃柏以及維生素類，經(jīng)過科學合理的比例配制而成，具有無毒無害無藥物殘留的優(yōu)點。復合免疫增強劑首次在冷水魚上研究應用，對冷水魚養(yǎng)殖中細菌病預防具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗金鱒體質(zhì)量為（98.6±5.3）g，采自北京市水產(chǎn)科學研究所延慶冷水魚基地。養(yǎng)殖試驗在天津市水產(chǎn)研究所循環(huán)水系統(tǒng)中進行，每個水族缸里飼養(yǎng)36 尾，水溫控制在（13±1）℃，溶氧保持在9.0 mg/L 以上，pH7.5 左右，氨氮濃度小于0.01mg/L。每天9:00 和16:00 投喂兩次飼料，馴化1 周正常攝食后開展試驗。

1.2 方法

試驗分3 個實驗組，在基部飼料中分別添加0.5%、1%和2%復合免疫增強劑和1 個不添加復合免疫增強劑的對照組，每組36 尾魚。試驗開始后第1、2、3 周和第4 周采血，每組采4 尾魚，采血部位為尾靜脈，血液4℃過夜，3000r/min 離心后取上清，收集血清，采用上海紀寧實業(yè)有限公司的試劑盒測定血清中溶菌酶（LYS）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性及補體C3 的含量。

投喂4 周后，采用濃度為3×108cfu/mL 的殺鮭氣單胞菌進行攻毒試驗。每尾魚注射0.2mL，統(tǒng)計各實驗組14d 內(nèi)死亡情況，按下式計算免疫保護率：免疫保護率=（1-實驗組發(fā)病率/對照組發(fā)病率）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差來表示，采用SPSS13.0 進行單因素方差分析，當差異顯著時（P＜0.05），采用LSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 對溶菌酶含量的影響

投喂非特異性免疫制劑對金鱒血清中溶菌酶含量的測定和標準曲線中R2=0.998，數(shù)據(jù)結果有效（圖1）。由圖2 可知，復合免疫增強劑添加量為0.5%時，第1 周金鱒血清中LYS 活性即達到最高值（5.35±0.09）U/mL，一直持續(xù)到第4 周（5.03±0.73）U/mL；當復合免疫增強劑添加量到1.0%時，金鱒血清中LYS 活性隨投喂時間延長先升高后降低，第2周達到最高值（5.42±0.38）U/mL，第4 周降低到（4.00±0.20）U/mL；當復合免疫增強劑添加量在2.0%時，金鱒血清中LYS 活性隨投喂時間呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在第2 周達到最高值（5.31±0.40）U/mL，第3 周降至（4.12±0.07）U/mL，可能添加量太高出現(xiàn)了免疫疲勞，第4 周為（4.62±0.37）U/mL，與對照組無顯著性差異（P＜0.05）（圖2）。

2.2 對超氧化物氣化酶活性的影響

投喂非特異性免疫制劑對金鱒血清中超氧化物氣化酶活性的測定和標準曲線的R2=0.994，數(shù)據(jù)結果有效（圖3）。

由圖4 可知，當復合免疫增強劑添加量在0.5%時，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時間升高，在第2周達到較高值（167.17±6.11）U/mL，第3 周時降至（142.00±3.04）U/mL，第4 周時（167.83±4.64）U/mL；第3 周低于第2 周和第4 周，可能是實驗誤差所致。當復合免疫增強劑添加量為1.0%時，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時間延長先升高后降低，第2 周達最高值（152.16±3.88）U/mL，第4 周降至（136.00±4.77）U/mL；當復合免疫增強劑添加量為2.0%時，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時間先升高后降低，在第2 周達到最高值（151.00±4.82）U/mL，第3 周降至（124.67±10.49）U/mL，可能添加量太高出現(xiàn)了免疫疲勞，第4 周為（133.17±1.61）U/mL，與對照組無顯著性差異（P＜0.05）（圖4）。

2.3 對補體C3 含量的影響

投喂非特異性免疫制劑對金鱒血清中補體C3含量的測定和標準曲線R2=0.993，數(shù)據(jù)結果有效（圖5）。

由圖6 可知，當復合免疫增強劑添加量在0.5%時，金鱒血清中C3 補體含量隨投喂時間延長先升高后降低，第2 周達到較高值（102.67±3.41）μg/mL，第4 周時降為（92.91±3.12）μg/mL，但仍高于對照組的（78.08±6.79）μg/mL；當復合免疫增強劑添加量為1.0%時，金鱒血清中SOD 含量隨投喂時間先升高后降低，第2 周達到最高值（105.58±2.02）μg/mL，第3 周降低到（96.00±1.73）μg/mL，第4 周與第3 周持平，但仍高于對照組（P＜0.05）；當復合免疫增強劑添加量為2.0%時，金鱒血清中補體C3 含量隨投喂時間延長先升高后降低，第2 周達到最高值（119.25±6.95）μg/mL，第4 周降為（94.67±1.84）μg/mL，但仍高于對照組（P＜0.05）（圖6）。

2.4 免疫保護率

由表1 可知，對照組在注射殺鮭氣單胞菌14d內(nèi)死亡率為80%，而各實驗組的死亡率較對照組有所降低，其中0.5%實驗組免疫保護率達到37.5%。

表1 金鱒攝食不同含量復合免疫增強劑的飼料后死亡率統(tǒng)計Tab.1 The statistics of mortality rate in golden trout（Oncorhynchus mykiss）fed diets containing various doses of compound immunostimulant

3 討論

3.1 復合免疫增強劑對金鱒血清中溶菌酶活性的影響

溶菌酶主要存在于魚的血清、粘液以及吞噬細胞中，是一種水解酶，具有防御各種病原體的作用，是魚體非特異性免疫功能主要標志之一。艾春漢[8]等研究表明：黃芪、五味子、黨參等中草藥能顯著提高鯽Carassius auratus 血清中溶菌酶的活力。羅璋[9]等研究表明，酵母細胞壁提升了斑點叉尾Ictalurus punctatus 溶菌酶的活性，增強了抗嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 感染的能力。胡兵[10]等發(fā)現(xiàn)添加0.05%黃芪多糖投喂異育銀鯽30d 后，血清溶菌酶活性達到最大值。胡宗云[11]等報道添加0.2%的硬葡聚糖對草魚Ctenopharyngodon idellus 溶菌酶活力影響極其顯著。王荻[12]等研究顯示復方中草藥顯著提高了施氏鱘Acipenser schrenckil 血漿等6種組織中的溶菌酶活力。Aramli 等[13]在飼料中添加0.2%和0.3%的β-葡聚糖，投喂波斯鱘Acipenser persicus 6 周后，可顯著提高血清中溶菌酶和總補體（ACH50）的含量。Ai Q 等[14]在飼料中添加0.09%和0.18%的β-葡聚糖，投喂大黃魚Pseudosciaena crocea 8 周后，血清中溶菌酶含量從對照組的97.00U/mL 分別提高到118.61U/mL 和131.87U/mL。本試驗中的金鱒在投喂含0.5%免疫復合增強劑的飼料1 周后血清中溶菌酶的含量顯著高于對照組，一直持續(xù)到第3 周和第4 周后溶菌酶的含量略有降低，高于對照組，但差異不顯著。

3.2 復合免疫增強劑對金鱒血清中超氧化物歧化酶的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是魚體非特異性免疫功能的重要指標。SOD 活性變化反映了機體清除自由基的能力，可增強吞噬細胞的防御能力和機體的免疫功能。胡兵等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可顯著提高異育銀鯽體內(nèi)的SOD 活性。李赫等[15]發(fā)現(xiàn)投喂含黃芪多糖、枸杞多糖和金絲桃素的飼料使草魚血清SOD 活性顯著高于對照組。李梅芳等[16]給大黃魚投喂不同中草藥飼料28d 內(nèi)，血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活性隨投喂時間延長而升高。本試驗中，金鱒攝食含0.5%免疫復合增強劑的飼料1 周后血清中超氧化物歧化酶的活性顯著高于對照組，維持到第2 周，第3 周后降低，高于對照組，但差異不顯著。

3.3 復合免疫增強劑對金鱒血清中補體C3 含量的影響

補體系統(tǒng)是魚體免疫的重要組成部分，主要功能是促進吞噬和溶解靶細胞。由補體介導的溶裂途徑清除病原是先天免疫反應的重要效應機制。樊英等[17]將黃芪多糖提取物來注射到刺參體腔，不同程度提高了刺參血清補體C3 的含量，起到了預防疾病的作用。盛竹梅等[18]將復方中草藥制劑投喂給黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco 30d 后，黃顙魚血清中補體C3 和C4 的含量顯著高于對照組。孟兆娜等[19]投喂復方中草藥14d 和28d 后鏡鯉幼魚血清補體C3 含量顯著高于對照組。本試驗中，第1 周各實驗組金鱒血清中補體C3 的含量便開始顯著高于對照組，一直持續(xù)到第4 周，與對照組之間仍具有顯著性差異。

3.4 復合免疫增強劑對金鱒抗病力的影響

在飼料中添加0.5%的復合免疫增強劑4 周后，金鱒感染殺鮭氣單胞菌的概率降低；進一步加大復合免疫增強劑的添加量，效果反而會降低，可能是出現(xiàn)了免疫疲勞。長期口服免疫增強劑會降低魚類免疫水平，可能是魚體的一種負反饋系統(tǒng)，使得免疫水平回落到最初的水平[20,21]。因此，投喂該復合免疫增強劑劑量不宜過高、時間也不宜過長，兩到三周比較合適，避免出現(xiàn)免疫疲勞。間隔一段時間可繼續(xù)投喂，使得免疫水平長期處于較高水平。

小結

目前，危害金鱒的疾病時有發(fā)生，使金鱒養(yǎng)殖業(yè)損失較大。本研究顯示，投喂0.5%復合免疫增強劑可有效提高金鱒血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性、補體C3 的含量，增強了魚體對細菌病的抵抗力。