何江峰，王力偉，2，房永雨，王蘊華，王 朝，劉紅葵

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

梭梭(Haloxylonammodendron)屬黎科(Chenopodiaceae)，為超旱生小喬木，呈高大灌木狀，植株高度一般在1～4 m，個別植株可高達8～10 m，亦稱鹽木、瑣瑣樹、梭梭柴。梭梭是肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)的寄主，肉蓯蓉是名貴的中藥材，在醫(yī)學(xué)上具有抗腫瘤、保肝、補腎、通便、抗老年癡呆、抗輻射等獨特功能，其寄生在梭梭的根端[1-2]。梭梭長期生長在荒漠環(huán)境中，形成了抗旱、抗風沙、耐高溫、耐寒、耐鹽堿和耐貧瘠等特性。因此，梭梭是荒漠化地區(qū)主要的防風固沙樹種，也可作為駱駝、羊適口性飼料，是荒漠草場中主要的木本飼料樹種之一[3]。梭梭具有重要的經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和飼用價值，是我國的二級保護植物，國內(nèi)外許多學(xué)者已從梭梭抗逆的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面進行了相關(guān)研究。

梭梭的生存環(huán)境極其嚴酷，其主要分布地區(qū)常年干旱少雨，年降水量不足50 mm，相對濕度低于40%，蒸發(fā)量高于降水量的30～100倍，生存環(huán)境的極端溫度最高可達40 ℃以上，最低為-40 ℃以下，地表溫度可達70 ℃以上[4]。為了適應(yīng)極端環(huán)境，梭梭逐步形成了自身的極端抗旱機制，但梭梭的抗旱機理、抗旱遺傳機制和抗旱相關(guān)組學(xué)的研究相對較少，前人研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄因子及與干旱脅迫相關(guān)，例如，AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子(TINY、CBF1、Ptis、AtEBP、DREB1、DREB2)主要調(diào)節(jié)植物對低溫、干旱及高鹽[5]等的分子應(yīng)答反應(yīng)；bZIP轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥基因組、豆科植物基因組、水稻基因組中參與對各種逆境脅迫的響應(yīng)[6-7]；擬南芥中3個NAC基因(ANAC019、ANAC055和ANAC072)的過表達能夠顯著提高植株對干旱的抗性[8]；許多NAC基因過表達能夠顯著提高水稻植株的脅迫抗性，卻不會減緩植株的正常生長[9-10]；bHLH基因也參與水稻應(yīng)對干旱脅迫的分子調(diào)控過程[11]。在改良植物的抗逆分子育種中，導(dǎo)入或改良轉(zhuǎn)錄因子較導(dǎo)入或改良個別功能基因在增強植物抗逆性方面更為有效。因此，本研究主要對干旱脅迫和復(fù)水處理下梭梭的轉(zhuǎn)錄因子進行分析，挖掘與干旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為闡明梭梭抗旱機理奠定理論基礎(chǔ)，保護及開發(fā)我國抗逆植物基因資源。

1 材料和方法

1.1 材料及處理條件

梭梭種子收集于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗。將梭梭種植在塑料花盆中(直徑：15 cm，高：18 cm)，盆內(nèi)土壤均勻，濕度及質(zhì)量均一致。梭梭幼苗在植物培養(yǎng)室種植，室內(nèi)溫度為24/20 ℃(16 h光照 / 8 h 暗處理)，相對濕度為30%，光子通量密度為350 μmol/(m2·s)。本研究隨機單株種植25盆梭梭幼苗，包括1個正常澆水組(對照組，CK)、干旱脅迫組(土壤相對含水量為30%～45%，LMS；土壤相對含水量為20%～25%，MWS；土壤相對含水量為10%～15%，SWS)和旱后復(fù)水處理組(土壤相對含水量為在重度水分脅迫組上增加10%～15%，RSWS)。干旱脅迫組、復(fù)水處理組和對照組的種植均設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，每天在固定時間測質(zhì)量、控水、補水并記錄待幼苗生長90 d之后，分別從CK、LWS、MWS、SWS 以及重度脅迫90 d之后復(fù)水處理7 d的RSWS的植株上采集等量的根、莖和葉混合，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆茫崛「魈幚淼目俁NA。

1.2 總 RNA 提取

材料總RNA的提取采用 RNAprep Pure Plant Plus KIT(DP441，TIANGEN北京生化科技有限公司)試劑盒。用 DNase酶(2212，大連寶生物工程有限公司)對樣品中的 gDNA 進行消化處理。RNA完整性和純度質(zhì)量經(jīng)1.2%非變性瓊脂糖凝膠電泳和 Agilent 2100 分析系統(tǒng)檢測。

1.3 RNA測序和分析方法

總RNA提取按照文獻[12]的方法，利用 Solexa/Illumina進行測序及深圳華大基因公司的Illumina系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)分析。RPKM值用于基因表達水平的分析，利用Cluster軟件[13]，以歐氏距離為距離矩陣計算公式，對基因和試驗條件同時進行等級聚類分析，聚類結(jié)果用Java Treeview顯示，利用WEGO軟件對差異基因做GO功能分類統(tǒng)計[14]，pathway顯著性富集分析以KEGG pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組相比后差異表達基因中顯著性富集的pathway基因和基因組的代謝途徑[15]。

1.4 de novo 拼接及序列分析

用Trinity[16]做轉(zhuǎn)錄組 de novo 組裝，并通過 reads overlap 關(guān)系得到 Contig。然后，將 clean reads 比對回Contig，通過paired-end reads 能確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同 Contig 以及這些 Contig 之間的距離，Trinity 將 Contig 連在一起，最后得到兩端不能再延長的序列，即為 Unigene。組裝得到的 Unigene，首先使用 Tgicl 將其去冗余并進一步拼接，然后再對這些序列進行同源轉(zhuǎn)錄本聚類，最終得到非冗余 Unigene。用 Tophat v2.0.9(Broad Institute)將拼接得到的非冗余 Unigene 與已公布的同種屬基因組信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比對、注釋，用已獲取各測序樣本中包含的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因信息。

1.5 差異表達基因的篩選

樣本中 Unigene 的表達量以公式化校正的 FPKM(Fragments per kb per million fragments)[17]值衡量。2個樣本間差異表達基因(Differential expression genes，DEGs)的篩選及分析使用DEGSeq R package軟件，以FDR(False discovery rate)≤0.001，且Log2(fold change，F(xiàn)C)≥1作為篩選閾值進行差異表達基因的篩選。

1.6 差異表達基因 Real-time PCR 驗證

從測序結(jié)果中隨機挑選 9 個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，用熒光實時定量 PCR 法驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的有效性和準確性。引物設(shè)計用 Primer 5 軟件，序列見表1。以18S為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計算，并校正目標基因在不同處理下的表達量，每個基因3次生物學(xué)重復(fù)。10 μL反應(yīng)體系中包括5 μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，TaKaRa Clontech，Japan)，5 μmol/L上游引物，5 μmol/L下游引物和20 ng 模板cDNA。所有反應(yīng)體系加樣都在96孔板進行，并在Lightcycle-480(羅氏)熒光定量PCR儀上完成，反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；后按95 ℃ 15 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。18S基因為擴增體系的內(nèi)參基因，擴增產(chǎn)物的表達水平按 2-ΔΔCt方法計算[18]。每個樣品都有3次技術(shù)重復(fù)，結(jié)果都以平均值±標準誤(s)(n= 3)計算。

表1 實時定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以梭梭幼苗為材料，對CK、LWS、MWS、SWS和RSWS處理組進行轉(zhuǎn)錄組測序和表達譜分析。對測序數(shù)據(jù)進行拼接、比對和整理，經(jīng)de novo 拼接、去冗余、同源轉(zhuǎn)錄本聚類后，最終在CK、LWS、MWS、SWS和RSWS 5個組中得到74 641條非冗余Unigene，平均長度780 bp，N50長度1 537 bp。 將CK、LWS、MWS、SWS和RSWS混合樣本拼接得到的非冗余Unigene進行比對、注釋，共檢測到56個轉(zhuǎn)錄因子家族，1 307個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因；在CK、LWS、MWS、SWS和RSWS組分別檢索到 934，978，994，1 003，991 條轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。LWS、MWS、SWS分別與CK組相比，RSWS與SWS相比，差異表達轉(zhuǎn)錄因子均以下調(diào)表達方式為主，CK-vs-SWS組中下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目最多，達112條，約占該組差異表達轉(zhuǎn)錄因子編碼基因總數(shù)的59.3%(表2)。

表2 差異表達轉(zhuǎn)錄因子

2.2 差異表達轉(zhuǎn)錄因子家族統(tǒng)計分析

獲得4個對比組轉(zhuǎn)錄因子基本數(shù)量信息后，進一步統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)錄因子家族及其包含成員的數(shù)量關(guān)系。LWS、MWS、SWS分別與CK組對比，RSWS與SWS相比，表3分析表明，其中，AP2-EREBP、WRKY、bHLH、MYB、NAC和ABI3VP1 家族富集的DEGs 超過該組差異表達基因總數(shù)的50%以上，其中AP2-EREBP、WRKY、MYB和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子較多。由圖1-A-C結(jié)果顯示，AP2-EREBP家族包含的下調(diào)差異表達基因，分別為6個(CK-vs-LWS)、17個(CK-vs-MWS)和 16個(CK-vs-SWS)DEGs，約占各組DEGs總數(shù)的75%，81%，59%；WRKY家族包含的下調(diào)差異表達基因，分別為6個(CK-vs-LWS)、12個(CKvs-MWS)和 2個(CK-vs-SWS)DEGs，約占各組DEGs總數(shù)的100%，100%，33%；bHLH家族包含的下調(diào)差異表達基因，分別為5個(CK-vs-LWS)、4個(CK-vs-MWS)和 16 個(CK-vs-SWS)DEGs，約占各組DEGs總數(shù)的100%，57%，84%；MYB家族包含的下調(diào)差異表達基因，分別為5個(CK-vs-LWS)、9個(CK-vs-MWS)和 10 個(CK-vs-SWS)，約占各組DEGs總數(shù)的100%，64%，45%。圖1-D結(jié)果顯示，AP2-EREBP家族、NAC家族和WRKY家族包含的上調(diào)差異表達基因分別占各自DEGs總數(shù)的67%，86%，75%。以上表達規(guī)律顯示，MYB和WRKY家族基因在LWS組中沒有上調(diào)表達，但在MWS和SWS中其上調(diào)表達數(shù)逐漸增加。綜合說明，RSWS組中偏向通過增加 AP2-EREBP、NAC家族和WRKY家族編碼基因的上調(diào)表達數(shù)來實現(xiàn)梭梭幼苗對水分刺激的應(yīng)答調(diào)節(jié)；而干旱組(LWS、 MWS和 SWS)更偏向于下調(diào)AP2-EREBP和bHLH 的DEGs數(shù)量來實現(xiàn)其對干旱脅迫的響應(yīng)。

表3 干旱和復(fù)水組各轉(zhuǎn)錄因子家族中的基因表達數(shù)

2.3 差異表達轉(zhuǎn)錄因子表達量分析

從4個對比組中挑選了表達量(FC)變化幅度最大的10個上調(diào)和下調(diào)基因，并對這些基因的表達規(guī)律進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明：差異表達基因Tify(CL5087)和NAC(Unigene28108)在干旱脅迫組(LWS、MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均上調(diào)表達，表達量(FC)變幅為1.23～12.24，2.89～11.37；AP2-EREBP(Unigene2016)、AP2-EREBP(Unigene442)和AP2-EREBP(Unigene160)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)中下調(diào)，在復(fù)水組(RSWS)中又上調(diào)表達。表達量變幅為-4.65～12.22，-8.31～7.38，-6.99～6.85。bHLH(CL2529)和E2F-DP(CL4870)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)中下調(diào)表達，變化幅度分別為-14.17～-3.73，-11.89～-4.56；在復(fù)水組中卻不表達。RWP-RK(CL8167)、DBP(CL6537)，在干旱脅迫組(LWS、MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均上調(diào)表達。BZIP(Unigene23554)在干旱脅迫組(LWS、 MWS和SWS)和復(fù)水組(RSWS)中均下調(diào)表達。綜合統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，AP2-EREBP、NAC、E2F-DP、bHLH 和BZIP等5類轉(zhuǎn)錄因子對干旱和水分刺激應(yīng)答顯著(表 4)。

A.CK-vs-LWS的差異表達基因； B.CK-vs-MWS的差異表達基因；C.CK-vs-SWS的差異表達基因； D.RSWS-vs-SWS的差異表達基因。

表4 對比組差異表達轉(zhuǎn)錄因子表達量分析

注：Log2(FC)≥1時，基因表達顯著。

Note:Gene expression is significant when Log2(FC)≥1.

2.4 Real-time PCR 驗證

從測序數(shù)據(jù)中隨機選取了9個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，用Real-time PCR 方法驗證測序數(shù)據(jù)的有效性。圖2顯示，干旱和水分刺激應(yīng)答相關(guān)的AP2-EREBP、WRKY、bHLH、MYB、C2C2-Dof、RWP-RK、NAC、C2H2和ABI3VP1編碼基因在處理前后表達量變化均極顯著。干旱脅迫組和復(fù)水組測序數(shù)據(jù)與用熒光定量PCR 法得到的基因表達數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分別為0.947 8(P<0.01)，0.967 2(P<0.01)，說明干旱脅迫和復(fù)水處理后產(chǎn)生的差異表達基因數(shù)據(jù)有效。

均值±s，樣本均為3個重復(fù)；不同大寫字母表示統(tǒng)計結(jié)果在1%水平上有顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對干旱脅迫和復(fù)水處理下梭梭轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的分子機理進行研究，發(fā)掘其中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對培育抗旱能力強、水分利用效率高的新作物品種具有重要的意義。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TFs)受脅迫刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，并將信號傳遞、放大，能夠通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率從多個層面降低脅迫對植物的傷害，對植物在逆境下的生長發(fā)育起到了至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是AP2-EREBP、 E2F/DP、MYB、NAC、WRKY、bHLH和BZIP等家族，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子，對干旱脅迫響應(yīng)和水分刺激應(yīng)答發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[19-23]。本試驗測序結(jié)果中，各對比組中 AP2-EREBP、MYB、bHLH、NAC、WRKY和ABI3VP1等轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的數(shù)量占主要比例，說明這幾類轉(zhuǎn)錄因子對梭梭干旱脅迫和水分刺激應(yīng)答調(diào)控作用極顯著，其中，AP2-EREBP、WRKY、MYB和bHLH是所有56個家族中差異表達轉(zhuǎn)錄因子成員最多的蛋白家族。AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子要調(diào)節(jié)植物對低溫、干旱及高鹽[23]等的分子應(yīng)答反應(yīng)。本研究中 AP2-EREBP是干旱和復(fù)水處理下數(shù)量豐富、表達量變化最顯著的一類轉(zhuǎn)錄因子，且AP2-EREBP(Unigene2016)、AP2-EREBP(Unigene442)和AP2-EREBP(Unigene160)，在干旱脅迫下顯著下調(diào)，而在復(fù)水組中顯著上調(diào)，與 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子類似，干旱脅迫處理下誘導(dǎo)更多的下調(diào)ERF轉(zhuǎn)錄因子表達，說明這類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控作用的模式可能與bHLH類似。本研究結(jié)果還表明，干旱處理和復(fù)水處理后下調(diào)的bHLH編碼基因數(shù)量均大于上調(diào)數(shù)，推測bHLH編碼基因主要通過下調(diào)其表達調(diào)控機體應(yīng)答脅迫過程。張子佳等[11]對水稻 22 個bHLH基因在PEG 和 ABA 脅迫下的表達譜進行了分析，結(jié)果表明，其中一些bHLH基因在響應(yīng)干旱脅迫過程中受ABA負調(diào)控。此外，不同的bHLH基因參與應(yīng)答環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)方式不同，表明參與 PEG 和 ABA 脅迫應(yīng)答的bHLH基因具有不同的分子路徑或模式。因此，梭梭中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的進一步研究已在該課題組將繼續(xù)進行。

Liao等[24]從研究的大豆基因中獲得了 156 個 MYB 家族基因，利用酵母單雜交的方法篩選出了40個左右與逆境相關(guān)的基因，將這些基因轉(zhuǎn)入擬南芥進行功能驗證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) GmMYB177 提高了擬南芥耐旱性。丁震乾等[25]在陸地棉中克隆了 MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因GhRAX3，發(fā)現(xiàn)其表達在干旱脅迫 0.5 h 后即表現(xiàn)為顯著上調(diào)，且 48 h 內(nèi)持續(xù)高表達水平；而抑制GhRAX3的表達，則加快了棉花植株的失水率、細胞質(zhì)膜過氧化和細胞受損程度，降低了棉花對干旱脅迫的耐受性。目前，發(fā)現(xiàn)的大多數(shù) MYB 類轉(zhuǎn)錄因子基因均表現(xiàn)為提高植物抗旱能力，但亦有例外，如 Zhou 等[26]的研究任務(wù)，將JcMYB001轉(zhuǎn)入擬南芥后，其過表達反而增加了擬南芥對干旱的敏感性。本研究中的MYB轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫組與對照組相比，其下調(diào)差異表達基因較其他轉(zhuǎn)錄因子多，MYB家族中上調(diào)基因數(shù)隨著干旱脅迫程度的增加而增加。說明本研究結(jié)果也證實了MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫具有正調(diào)控和負調(diào)控性。

綜合以上結(jié)果推測，發(fā)揮主要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族或成員間可能存在一定的共表達性或相互關(guān)聯(lián)性，各轉(zhuǎn)錄因子間協(xié)同作用對干旱和水分刺激做出精細應(yīng)答調(diào)控。植物對干旱脅迫和水分刺激應(yīng)答過程受眾多分子和細胞通路的調(diào)控[27]。轉(zhuǎn)錄因子能特異與順式作用元件結(jié)合激活或抑制下游靶基因表達，參與脅迫信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，其“閥門作用”的重要性不言而喻。本研究借助高通量測序技術(shù)，從整體層面概要性的分析了干旱和干旱后復(fù)水處理下梭梭幼苗轉(zhuǎn)錄因子種類及初步的表達規(guī)律，結(jié)果將為干旱脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、有目的地篩選關(guān)鍵調(diào)控基因和分子設(shè)計育種等研究提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。