劉松濤，曹雯梅，鄭貝貝，趙 威

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

干旱脅迫對玉米造成的產(chǎn)量損失越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，干旱脅迫已然成為限制玉米生長發(fā)育和產(chǎn)量最重要的非生物脅迫之一。早年有研究者報(bào)道，在大喇叭口期，玉米受旱1 d可導(dǎo)致減產(chǎn)3%；抽雄吐絲期受旱1 d可減產(chǎn)7%，甚至高達(dá)13%[1]。但是植物自身存在一套保護(hù)系統(tǒng)，在受到旱脅迫的時(shí)候，本能地會從生理、細(xì)胞和分子水平上做出反應(yīng)，誘導(dǎo)許多脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，很大程度上促進(jìn)一些參與抗旱防御代謝產(chǎn)物的合成，從而調(diào)節(jié)植物對旱脅迫的耐受性[2-3]。其中早期脫水反應(yīng)(ERD)基因，在植物逆境脅迫和生長發(fā)育中具有功能性作用。

擬南芥ERD最早被鑒定，目前有16個(gè)成員，它們分為不同的基因家族，包括熱激蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、晚期胚發(fā)育蛋白、鈣離子調(diào)控蛋白等，作用于不同的代謝合成途徑，可傳遞旱脅迫信號，產(chǎn)生功能性蛋白，從而增強(qiáng)擬南芥對水分脅迫的抗性[4-5]。隨后與擬南芥ERD4同源的水稻和玉米基因也先后被獲得。ZmERD4基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，其表達(dá)量受干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，但是低溫脅迫下其表達(dá)量無變化，并且過表達(dá)ZmERD4基因提高了擬南芥的抗旱能力和耐鹽性，因此，ZmERD4基因在植物生長發(fā)育中積極響應(yīng)逆境脅迫[6-7]。擬南芥ERD6基因是在水分脅迫1 h后被鑒定到的，該基因被證實(shí)有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且編碼1個(gè)糖載體蛋白，表達(dá)量受旱脅迫影響又受低溫干預(yù)[8-9]。

關(guān)于玉米中ERD6基因，目前只鑒定到2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，存在2個(gè)Major facilitator superfamily(MFS)結(jié)構(gòu)域，是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子，且屬于ABA合成依賴途徑，但是該基因在不同抗旱型材料中的旱脅迫表達(dá)量、不同玉米組織中的表達(dá)模式以及編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位尚未研究。本研究從前期旱脅迫轉(zhuǎn)錄組差異基因簇中，發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異表達(dá)的玉米ERD基因，通過分析5個(gè)基因與16個(gè)擬南芥ERD基因編碼蛋白質(zhì)的關(guān)系、基因的時(shí)空表達(dá)模式及在旱敏感和抗旱性強(qiáng)的2個(gè)材料中的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位，初步驗(yàn)證了ZmERD6基因的潛在功能和表達(dá)模式，為培育抗旱型種質(zhì)提供優(yōu)質(zhì)的分子資源，同時(shí)為將來進(jìn)一步研究該基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以旱敏感型(B73)和抗旱型(鄭58)玉米自交系為試驗(yàn)材料。取大田正常水分下生長B73的幼根、幼葉、成熟根、莖、成熟葉、花藥、胚、胚乳和種子作為時(shí)空表達(dá)分析的樣品。溫室內(nèi)B73和鄭58植株生長條件為：30 ℃光照培養(yǎng)16 h、26 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度為40%～55%；當(dāng)B73和鄭58長至三葉期時(shí)，對長勢旺盛大小一致的玉米苗進(jìn)行PEG(Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG)處理，分別在脅迫6，12 h時(shí)取每個(gè)處理材料的葉片。以上試驗(yàn)樣品5株相同部位混在一起為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)部位3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將采集的樣品迅速放入液氮冷凍后，存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 玉米總RNA提取及qRT-PCR分析

利用EasyPure RNA Purification Kit提取以上試驗(yàn)樣品的總RNA，然后根據(jù)TansScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis試劑盒說明書所提供的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異熒光引物，并以玉米18S為內(nèi)參(表1)。利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，USA)，參考SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)試劑盒說明書，采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCT法(ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT處理后-ΔCT對照)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 ZmERD基因的生物信息學(xué)分析

使用EXPASY中的protparam在線對編碼的ZmERD蛋白等電點(diǎn)(pI)、分子質(zhì)量(MW)等屬性進(jìn)行計(jì)算；使用Softberry網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；利用MEGA軟件中的NJ法構(gòu)建ZmERD蛋白與AtERD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 ZmERD6蛋白的亞細(xì)胞定位

對GRMZM2G109201基因設(shè)計(jì)特異引物，其中劃線部分分別為SpeⅠ和AscⅠ酶切位點(diǎn)(表1)。將擴(kuò)增的GRMZM2G109201基因產(chǎn)物，經(jīng)SpeⅠ和AscⅠ雙酶切后用T4DNA連接酶連接到過表達(dá)載體pMDC83，轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測序驗(yàn)證。將正確的融合過表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，將陽性克隆的農(nóng)桿菌重懸液通過注射法浸染六葉期的本氏煙葉片，48 h后將注射孔部位的葉片表皮組織倒置于共聚焦熒光顯微鏡下，觀察本氏煙表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)情況，對GRMZM2G109201基因編碼的ZmERD6蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmERD基因的結(jié)構(gòu)分析

對旱脅迫轉(zhuǎn)錄組水平篩選到的5個(gè)ZmERD基因進(jìn)行分析(表2)，發(fā)現(xiàn)基因?qū)儆?類，一類為SUGAR TRANSPORTER ERD6，一類為EARLY-RESPONSIVE TO DEHYDRATION STRESS(ERD4)。利用phytozome網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)第一類基因含有超家族結(jié)構(gòu)域，第二類含有鈣依賴通道、晚期胞吐作用和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。5個(gè)基因的氨基酸個(gè)數(shù)和等電點(diǎn)、分子質(zhì)量相差較大，但是經(jīng)預(yù)測均定位于質(zhì)膜。

表1 研究所用的引物及用途

注：ZmERD6對應(yīng)GRMZM2G109201基因；_.限制性酶位點(diǎn)。

Note：ZmERD6corresponds to theGRMZM2G109201gene；_.Restriction enzyme site.

表2 ZmERD基因的結(jié)構(gòu)分析

2.2 ZmERD編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了研究玉米這5個(gè)ZmERD基因與擬南芥之間的進(jìn)化關(guān)系，利用NJ法構(gòu)建ZmERD蛋白與AtERD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖1可以看出，GRMZM2G181206-P01(ERD4)蛋白與擬南芥AT4G02900蛋白，GRMZM2G128641-P01(ERD4)蛋白與AT1G32090蛋白序列相似度較高，進(jìn)化關(guān)系較緊密。其他幾個(gè)ZmERD蛋白與擬南芥的ERD蛋白同源性較低。對與擬南芥AtERD4基因同源的ZmERD4基因在旱、鹽、ABA、低溫等誘導(dǎo)下的表達(dá)情況和抗逆性研究較多，但是關(guān)于ZmERD6基因報(bào)道較少，值得進(jìn)一步探究，故本研究對其中1個(gè)ZmERD6(GRMZM2G109201)基因進(jìn)行不同材料、不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)分析。

2.3 ZmERD基因的組織表達(dá)模式分析

為了解ZmERD基因在玉米不同部位、不同階段的表達(dá)模式，利用qRT-PCR分析其中4個(gè)ZmERD基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖2)，GRMZM2G109201基因在胚和胚乳中不表達(dá)，在幼根和幼葉中表達(dá)量相對較高；GRMZM2G181206基因在花藥中表達(dá)量最高，就發(fā)育的胚乳而言，基因在授粉30 d的胚乳中表達(dá)量最高；GRMZM2G128641基因在各個(gè)組織均表達(dá)，但隨著授粉時(shí)間的延長表達(dá)量越來越高，在授粉40 d的胚乳中表達(dá)量是其他組織的2倍，甚至5倍；而GRMZM2G134192基因只在花藥中高表達(dá)，其他部位基本不表達(dá)。也就是說，前3個(gè)基因?yàn)榻M成型表達(dá)基因，后者為特異性表達(dá)基因。

圖1 玉米與擬南芥ERD蛋白的進(jìn)化樹

YR.幼根；YL.幼葉；MR.成熟根；S.莖；ML.成熟葉；As.花藥；Em.胚；En-S1.授粉10 d的胚乳；En-S2.授粉20 d的胚乳；En-S3.授粉30 d的胚乳；En-S4.授粉40 d的胚乳；Sd.種子。

2.4 GRMZM2G109201基因?qū)得{迫的響應(yīng)分析

為了初步研究GRMZM2G109201基因是否響應(yīng)旱脅迫，及在不同抗旱型材料中的表達(dá)情況，利用B73和鄭58為試驗(yàn)材料，進(jìn)行熒光定量PCR分析。由圖3可以看出，該基因在2種材料中均表達(dá)。在旱敏感型材料B73中，延長脅迫時(shí)間(從6 h到12 h)，基因表達(dá)量變化不大；但是在抗旱型材料鄭58中，隨著脅迫時(shí)間的增加，基因表達(dá)量升高幅度達(dá)到了顯著差異水平。比較該基因在二者中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，2個(gè)脅迫點(diǎn)鄭58的表達(dá)量均顯著高于B73(P<0.05)。初步說明GRMZM2G109201基因參與旱脅迫，且被旱脅迫正向誘導(dǎo)。

2.5 ZmERD6蛋白的定位分析

利用農(nóng)桿菌法將構(gòu)建好的ZmERD6-pMDC83-GFP載體和pMDC83-GFP空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片(圖4)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照空載體pMDC83-GFP在煙草的細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均有綠色的熒光信號表達(dá)；但含有ZmERD6-pMDC83-GFP的融合表達(dá)載體只在質(zhì)膜中觀察到綠色熒光信號，說明ZmERD6蛋白定位于質(zhì)膜中，與預(yù)測結(jié)果一致。

x軸中的6和12分別代表PEG脅迫的時(shí)間6 h和12 h；相同字母表示差異不顯著;不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

The numbers 6 and 12 in the x-axis represent the time of PEG stress，6 h and 12 h，respectively；Identical letters indicate no significant difference; Different letters indicate significant difference(P<0.05).

圖3GRMZM2G109201基因?qū)得{迫的響應(yīng)

Fig.3 Response ofGRMZM2G109201gene to drought stress

圖4 ZmERD6的亞細(xì)胞定位

3 結(jié)論與討論

玉米產(chǎn)量的安全問題是國之大事，而旱脅迫又頻頻嚴(yán)重發(fā)生，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，要減少或解決這個(gè)問題，必須培育出抗旱型新品種。從分子層面來講，就是挖掘抗旱型基因，通過轉(zhuǎn)基因或者分子輔助育種，將優(yōu)質(zhì)的抗旱型基因?qū)氲焦歉勺越幌抵衃10-11]。擬南芥上早有報(bào)道，ERD1基因編碼1個(gè)Clp蛋白酶，該基因的表達(dá)受干旱和自然衰老等信號的誘導(dǎo)[9]；ERD4編碼1個(gè)整合蛋白，其表達(dá)受水分脅迫和ABA的誘導(dǎo)[6，12]；ERD14編碼脫水素蛋白，干旱處理1 h后在葉片中強(qiáng)烈表達(dá)，還受ABA誘導(dǎo)的影響[13]；ERD15編碼1個(gè)小的酸性蛋白，該基因表達(dá)受干旱、高鹽、低溫等多種生物和非生物脅迫影響，過表達(dá)ERD15基因則降低了植物對干旱、低溫等處理的耐性[14-15]。但玉米上對ERD的報(bào)道較少，故本研究對ERD基因從進(jìn)化、表達(dá)模式、響應(yīng)旱脅迫情況、亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行研究，以期初步篩選到潛在的抗旱基因，并為了解玉米ERD基因打下基礎(chǔ)。

為了解玉米ERD與擬南芥ERD的進(jìn)化關(guān)系，利用NJ構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)GRMZM2G181206-P01蛋白與擬南芥AT4G02900蛋白同源性很高，GRMZM2G128641-P01蛋白與AT1G32090蛋白同源性也很高。AT4G02900和AT1G32090基因?qū)儆贑SC1家族，CSC1是一類高滲脅迫的感受蛋白，擬南芥、水稻、番茄、小麥等作物中已證實(shí)，該家族在滲透脅迫調(diào)節(jié)方面起重要作用[15-21]。GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因?qū)儆谠缙陧憫?yīng)脫水脅迫基因(ERD4)，含有鈣依賴通道，晚期胞吐作用和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。推測玉米的GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因或許也存在潛在的滲透調(diào)節(jié)功能，值得進(jìn)一步研究。

時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G109201、GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，但是GRMZM2G109201基因在胚和胚乳中不表達(dá)，GRMZM2G181206基因在授粉30 d的胚乳中表達(dá)量最高，GRMZM2G128641基因在授粉40 d的胚乳中表達(dá)量達(dá)到峰值。GRMZM2G109201基因?qū)儆诰幋a糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(ERD6)，含有超家族結(jié)構(gòu)域。它們同屬于ERD基因，但由于結(jié)構(gòu)域不同，所屬的大家族不同，基因的表達(dá)模式也不盡相同。

對不同抗旱型材料分析旱脅迫下GRMZM2G109201基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在旱敏感型材料B73中，延長脅迫時(shí)間(6～12 h)，基因表達(dá)量變化不大；但是在抗旱型材料鄭58中，隨著脅迫時(shí)間的增加，基因表達(dá)量升高較多；且2個(gè)脅迫點(diǎn)中鄭58的表達(dá)量均顯著高于B73。GRMZM2G109201基因?qū)儆诰幋a糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因 (ERD6)。推測GRMZM2G109201基因參與旱脅迫過程，且被正向積極誘導(dǎo)；或許其他ERD6基因也存在類似的功能，值得進(jìn)一步深入研究。

GRMZM2G109201基因編碼的ZmERD6蛋白定位于質(zhì)膜，前人研究發(fā)現(xiàn)ZmERD16蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和核中[19]，GRMZM2G109201基因編碼的ZmERD6蛋白屬于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而ZmERD16是一個(gè)泛素延伸蛋白，推測定位不同的原因或許是蛋白質(zhì)家族及結(jié)構(gòu)域的不同導(dǎo)致的作用機(jī)制不同。

本研究基于旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出5個(gè)ZmERD基因，發(fā)現(xiàn)屬于ERD4類型的GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因編碼的蛋白質(zhì)分別與擬南芥上2個(gè)CSC1感受蛋白高度同源，這2個(gè)基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，且表達(dá)量隨著授粉時(shí)間延長而增高；ERD6類的GRMZM2G134192基因?qū)儆谔禺愋捅磉_(dá)，只在花藥中高表達(dá)。旱脅迫分析顯示，屬于ERD6類的GRMZM2G109201基因在抗旱型自交系中高表達(dá)，且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其編碼的蛋白質(zhì)位于質(zhì)膜上。以上結(jié)果為進(jìn)一步了解ZmERD基因奠定基礎(chǔ)，也為篩選抗旱型基因提供參考。