關(guān)鵬　秦培鋼　代小娟　宋金東

摘要：采用5對(duì)引物組合經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增對(duì)蘇云金芽孢桿菌QL75-2菌株中的cry基因進(jìn)行鑒定，克隆得到1個(gè)cry1Da型基因片段。通過(guò)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物擴(kuò)增得到該cry基因的全長(zhǎng)序列，轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體pET-28a中，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，最后對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行生物活性分析。序列分析結(jié)果表明，該cry1Da基因全長(zhǎng)3 495 bp，推測(cè)其編碼1 164個(gè)氨基酸，組成分子量約132.01 ku的蛋白質(zhì)。該預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與已知的Cry1Da3蛋白質(zhì)具有最高的序列同源性（99.7%），該基因被國(guó)際殺蟲晶體蛋白基因命名委員會(huì)正式命名為cry1Da5。生物活性分析結(jié)果表明，Cry1Da5蛋白質(zhì)對(duì)鱗翅目的甜菜夜蛾幼蟲具有較強(qiáng)的殺蟲活性，其LC50為21.47 μg/mL，而對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲幼蟲無(wú)殺蟲活性。因此，cry1Da5基因可作為一個(gè)新的cry基因資源在甜菜夜蛾的生物防治中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌;簡(jiǎn)并引物;cry1Da5基因;棉鈴蟲;甜菜夜蛾;殺蟲活性

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0118-05

收稿日期：2018-10-26

作者簡(jiǎn)介：關(guān) 鵬（1984—），男，陜西渭南人，博士，講師，主要從事微生物殺蟲劑研究。E-mail：guanpeng0719@163.com。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在芽孢形成過(guò)程中能夠產(chǎn)生形態(tài)多樣的伴胞晶體（又稱殺蟲晶體蛋白或 δ- 內(nèi)毒素，由cry、cyt基因編碼），這些伴胞晶體對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、螨類、線蟲等農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲具有特異性的殺蟲活性[1-2]，因此Bt菌株及其殺蟲基因被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林、衛(wèi)生害蟲的生物防治。

在已知的75類cry基因中，cry1類基因編碼蛋白主要對(duì)鱗翅目害蟲具有廣泛的殺蟲活性，然而不同的Cry1類蛋白存在不同的殺蟲譜。例如Cry1Ac和Cry1Ca對(duì)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲均有顯著的殺蟲活性[3-5];棉鈴象甲（Anthonomus grandis）和草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼蟲對(duì)Cry1Ia敏感[6];Cry1Ab和Cry1Fa主要對(duì)玉米螟（Corn bore）、草地夜蛾幼蟲具有較強(qiáng)的殺蟲活性[7];Cry1Da對(duì)甜菜夜蛾、小菜蛾（Plutella xylostella）等夜蛾科害蟲具有明顯的殺蟲活性[8-10]。

cry基因的鑒定多采用宋福平等建立的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）基因鑒定體系[11]，通過(guò)對(duì)同一大類的不同cry基因進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)該類型cry基因的通用引物，然后利用PCR的方法對(duì)Bt菌株中的cry基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并采用不同的DNA內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定。本研究采用的是Berón等創(chuàng)建的一種新的cry基因鑒定方法[12]，首先對(duì)不同大類cry基因編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，得到蛋白質(zhì)的保守區(qū)域，然后根據(jù)其對(duì)應(yīng)的核酸序列，分別設(shè)計(jì)5條簡(jiǎn)并引物，然后通過(guò)2輪PCR擴(kuò)增，并結(jié)合測(cè)序方法對(duì)Bt QL75-2菌株中的cry基因進(jìn)行鑒定、全長(zhǎng)擴(kuò)增及原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行殺蟲活性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生型蘇云金芽孢桿菌QL75-2菌株、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試?yán)ハx 棉鈴蟲、甜菜夜蛾幼蟲為筆者所在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試?yán)ハx。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：稱取10 g蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物，加無(wú)菌水定容至 1 000 mL;LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉;1/2 LB液體培養(yǎng)基：將LB液體培養(yǎng)基中的各成分均減半后，加無(wú)菌水定容至1 000 mL;1/2 LB固體培養(yǎng)基：在1/2 LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉。將配制好的培養(yǎng)基置于121 ℃條件下高溫蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 試劑 pMD19-T載體、T4 DNA連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司;DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、氨芐青霉素、X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;Axygen DNA凝膠回收試劑盒、Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt質(zhì)粒DNA的提取及cry基因的鑒定 采用 Reyes-Ramírez等的方法[13]提取Bt質(zhì)粒DNA。cry基因的鑒定參考Berón等的方法[12]，首先以Bt QL75-2菌株質(zhì)粒DNA為模板，使用OL1和OL5引物組合進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后作為擴(kuò)增模板，采用OL1-OL5、OL1-OL4、OL2-OL5、OL2-OL4、OL3-OL5等5對(duì)引物組合分別進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性45 s，40 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)35次;72 ℃ 延伸3 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收，將回收產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 cry基因的全長(zhǎng)克隆及測(cè)序 利用NCBI BLASTx在線分析工具對(duì)“1.2.1”節(jié)中擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成cry基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（正向引物cry1Da-F：5′-ATGGAGATAAATAATCAG-3′，反向引物cry1Da-R：5′-CTATTCCTCCATAAGGAG-3′）。將擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性單克隆，最后對(duì)陽(yáng)性單克隆中的插入基因序列進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 cry1Da基因的序列分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTx工具對(duì)cry1Da基因序列進(jìn)行同源性分析;采用Vector NTI Advance 11和DNAStar軟件對(duì)cry1Da基因及相似序列進(jìn)行多序列比對(duì);采用DNAMAN 6.0.40軟件選擇基因酶切位點(diǎn)，并對(duì)通過(guò)cry1Da基因預(yù)測(cè)的編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 cry1Da5基因的原核表達(dá)及檢測(cè) 根據(jù)大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a的多克隆位點(diǎn)，使用DNAMAN 6.0.40軟件對(duì)cry1Da5基因序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)并合成cry1Da5基因表達(dá)擴(kuò)增引物，正向引物cry1Da5-F：5′-GCGTCGACATGGAGATAAATAATCAG-3′（下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物cry1Da5-R：5′-CCGCTCGAGCTATTCCTCCATAAGGAG-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），使用高保真Pfu DNA聚合酶對(duì)Bt QL75-2菌株中的cry1Da5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-28a載體分別經(jīng)過(guò)SalⅠ和XhoⅠ的雙酶切后，通過(guò)T4連接酶連接，獲得重組子pET-cry1Da5，將重組子轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中;對(duì)陽(yáng)性單克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析驗(yàn)證;最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，加入 200 μL 1 μmol/mL IPTG溶液，在28 ℃，200 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h。取少量培養(yǎng)產(chǎn)物用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白電泳檢測(cè)[14]。Cry1Da5表達(dá)蛋白的提取參考Schgger等的方法[15]。

1.2.5 Cry1Da5蛋白殺蟲活性的測(cè)定 將稱質(zhì)量后的Cry1Da5表達(dá)蛋白加入到10 mL無(wú)菌水中，振蕩混勻制成懸液，采用梯度稀釋法將懸液濃度分別稀釋為5、10、20、40、80、160 μg/mL等，分別與適量養(yǎng)蟲飼料均勻混合，分裝于12孔培養(yǎng)板中。每孔放2頭二齡期棉鈴蟲或甜菜夜蛾幼蟲，每個(gè)濃度重復(fù)3次，將加無(wú)菌水的飼料作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3～5 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。采用SPSS 10.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算致死中濃度（LC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt QL75-2菌株中cry基因的鑒定

DNA電泳結(jié)果（圖1）表明，5對(duì)引物組合均可擴(kuò)增得到產(chǎn)物，其中OL1-OL5、OL2-OL5、OL3-OL5引物組合均擴(kuò)增得到1個(gè)大小約500 bp的DNA片段;OL2-OL4引物組合擴(kuò)增得到1個(gè)大小約750 bp的產(chǎn)物;OL1-OL4引物組合擴(kuò)增得到1個(gè)大小約1.1 kb的DNA片段。對(duì)這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，OL1-OL4引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)1 126 bp，是與已知的cry1Da3基因序列同源性為99.8%的cry1Da型基因片段;而另外4對(duì)引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物均非cry基因片段。

2.2 cry基因的全長(zhǎng)克隆及其序列分析

利用引物cry1Da-F和cry1Da-R對(duì)“21”節(jié)中的cry1Da型基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖2）表明，擴(kuò)增得到1個(gè)長(zhǎng)約3.5 kb的DNA序列。對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)序分析，生物信息學(xué)分析結(jié)果（圖3）表明，該基因序列全長(zhǎng)3 495 bp，推測(cè)其編碼1 164個(gè)氨基酸（圖4），組成分子量約為132.01 ku的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為5.29。Cry1Da類蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析結(jié)果（表2）表明，本研究預(yù)測(cè)的Cry1Da蛋白質(zhì)與其他已知的Cry1Da類蛋白質(zhì)的氨基酸序列均存在差異，該蛋白質(zhì)與已知的Cry1Da3蛋白質(zhì)具有最高的序列同源性（997%），二者之間僅有4個(gè)氨基酸不同。根據(jù)國(guó)際Bt殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因的命名規(guī)則，該基因被正式命名為cry1Da5（GenBank登錄號(hào)為MG181949）。

2.3 cry1Da5基因的原核表達(dá)

表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果（圖5）表明，cry1Da5基因表達(dá)大小約130 ku的產(chǎn)物，這與預(yù)測(cè)的cry1Da5基因編碼的蛋白質(zhì)分子量大小一致。

2.4 Bt QL75-2菌株的生物活性分析

生物活性測(cè)定分析結(jié)果（表3）表明，Cry1Da5蛋白質(zhì)對(duì)鱗翅目的甜菜夜蛾幼蟲具有較明顯的殺蟲活性，其LC50為21.47 μg/mL，95%的置信區(qū)間為18.33～24.61 μg/mL;但是該蛋白質(zhì)對(duì)棉鈴蟲幼蟲不具有殺蟲活性。

3 討論

本研究采用Berón等的方法[12]從Bt QL75-2菌株中鑒定得到1個(gè)cry1Da5基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可行性。該鑒定方法與宋福平等的方法[11]相比，其優(yōu)點(diǎn)為：（1）合成引物少，節(jié)約引物合成的成本;（2）對(duì)于較多Bt菌株的鑒定，所進(jìn)行的PCR擴(kuò)增次數(shù)較少，且省去了雙酶切檢驗(yàn)的過(guò)程;（3）采用簡(jiǎn)并引物對(duì)cry基因進(jìn)行鑒定，易得到新型基因。然而該方法也存在一些缺點(diǎn)，在PCR擴(kuò)增中引物的錯(cuò)配率較高，非目標(biāo)產(chǎn)物較多，且PCR產(chǎn)物主要通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證其正確性，導(dǎo)致測(cè)序成本較高。

生物活性分析結(jié)果表明，Cry1Da5蛋白質(zhì)對(duì)甜菜夜蛾具有較強(qiáng)的殺蟲活性，另外，序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cry1Da5與Cry1Da3蛋白質(zhì)的同源性最高，僅有4個(gè)氨基酸存在差異，而黃天培等研究發(fā)現(xiàn)，Cry1Da3蛋白質(zhì)對(duì)甜菜夜蛾和小菜蛾均具有高效的殺蟲活性[16]，因此，上述研究結(jié)果均證實(shí)了Cry1Da類蛋白質(zhì)主要對(duì)夜蛾科昆蟲具有特異性的殺蟲活性。

盡管cry基因被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲的生物防治，但是昆蟲的抗性問題一直是cry基因應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。近年來(lái)，新cry基因資源的不斷挖掘、不同cry基因的重組或協(xié)同表達(dá)成為解決昆蟲抗性問題的有效方法。因此，新發(fā)現(xiàn)的cry1Da5基因?qū)⒆鳛樾碌膫溥x基因在害蟲生物防治中被應(yīng)用。

表2 Cry1Da與其他Cry1Da類蛋白質(zhì)氨基酸序列間的差異性比較

名稱差異氨基酸數(shù)目（個(gè)）Cry1Da1Cry1Da2Cry1Da3Cry1Da4Cry1Da383846

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