李華振 狄 冉 郭曉飛 張金龍 張效生 馬 琳 劉武軍 儲明星*

(1.中國農業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.新疆農業(yè)大學 動物科學學院，烏魯木齊 830052；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

大多數綿羊品種(Ovisaries)具有季節(jié)性發(fā)情的特點，該類品種僅在秋、冬季節(jié)等短日照條件下出現發(fā)情行為。少數綿羊品種如小尾寒羊等可以四季發(fā)情配種產羔，顯著提高繁殖效率。因此，研究綿羊季節(jié)性發(fā)情形成的生理和分子機制，可為提高綿羊繁殖效率提供科學依據。色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylases, TPH)屬于蝶呤依賴性芳香族氨基酸羥化酶家族的成員，作為褪黑激素(Melatonin, MEL)生物合成的第一個酶，在所有脊椎動物的松果體中大量表達[1]。已有研究表明褪黑激素是調控綿羊季節(jié)性發(fā)情的重要因子，因此TPH可能通過影響褪黑激素的合成，進而影響綿羊繁殖軸激素分泌進而調控動物發(fā)情行為[2]。

已發(fā)現的色氨酸羥化酶有TPH1和TPH2，這2 個基因分別位于綿羊的15號和3號染色體上。TPH1主要在胃腸道和松果體等周圍組織表達；TPH2主要在大腦和下丘腦的5-羥色胺能神經元以及腸神經系統(tǒng)的神經元中表達[3]。TPH能催化L-色氨酸向5-羥基-L-色氨酸(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)的轉化，該反應是5-HT生物合成中的初始和限速步驟，而5-HT是MEL的前體產物[4]。5-HT 能神經元是胚胎最早產生的神經元之一，參與調節(jié)腦回路的結構和可塑性，并且在常規(guī)突觸建立之前通過發(fā)育的軸突釋放5-HT[5]。最初藥理學研究表明，5-HT可以調節(jié)許多發(fā)育過程，包括細胞分裂、細胞分化、神經元遷移及突觸發(fā)生[6]。5-HT在下丘腦內側視前區(qū)中能神經元突出連接GnRH神經元，能直接負調控GnRH的分泌[2]。增加內源性局部或者外周血液中5-HT水平導致促黃體素(Luteinizing hormone, LH)分泌減少[7]，并在母羊、大鼠[2]等中得到類似的結果。由于5-HT由TPH催化產生，證實TPH在上游組織中可通過調控5-HT分泌影響繁殖軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA)軸激素表達[2]。已有研究發(fā)現去卵巢母猴在雌激素(E)和孕酮(P)處理下，下丘腦局部區(qū)域TPH2mRNA表達增加[9]。人類注射雌激素后，發(fā)現E能誘導5-HT神經元中的孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)表達，表明TPH(尤其TPH2)可能也受到HPGA中的E影響[10]。

已有研究表明TPH能參與調控繁殖生理過程，是繁殖通路中的重要組成部分[10]。但對TPH基因在不同繁殖狀態(tài)下綿羊性腺軸相關組織中表達差異和參與季節(jié)性發(fā)情和繁殖時期轉換方面的研究鮮有報道。因此，本試驗擬以卵泡期和黃體期的成年小尾寒羊母羊(常年發(fā)情品種)和長光照和短光照條件下的蘇尼特羊母羊(季節(jié)性發(fā)情品種)為研究對象，采用qPCR法檢測TPH基因在不同繁殖狀態(tài)下綿羊繁殖軸10 種不同組織中的表達情況；并利用MassARRAY飛行質譜技術(Time-of-flight mass spectrometer, TOF-MS)[11]檢測6個綿羊品種TPH2基因多態(tài)性，通過統(tǒng)計學將TPH2基因多態(tài)性與綿羊2 個繁殖性狀(季節(jié)性發(fā)情和產羔數)進行關聯分析。旨在揭示或完善綿羊繁殖分子調控機制，以期提高季節(jié)性發(fā)情綿羊的繁殖效率。

1 材料與方法

1.1 試驗羊選擇及處理

選擇6 只健康狀態(tài)良好的空懷小尾寒羊母羊(采樣地點：山東省，鄆城縣)，在其陰道內放置孕酮陰道栓(Controlled intcmal drug release device，CIDR，InterAg公司，新西蘭)進行同期發(fā)情，12 d后撤栓，分別采集卵泡期(撤栓后第3天)和黃體期(撤栓后第9天)性腺軸相關組織備用。

選擇天津市畜牧獸醫(yī)研究所畜禽繁育基地人工控光條件下飼養(yǎng)的6 只健康狀態(tài)良好的蘇尼特羊母羊，首先在短光照(Short day, SD)條件下(光照/黑暗：8 h/16 h，人工模擬發(fā)情季節(jié))飼養(yǎng)42 d后，轉至長光照(Long day, LD)條件下(光照/黑暗：16 h/8 h，人工模擬休情季節(jié))飼養(yǎng)49 d，并根據文獻報道，分別在SD 21和LD 492 個時間點采集性腺軸相關組織；

分型樣品選擇：小尾寒羊(山東省鄆城縣)27 只、湖羊(江蘇省徐州市)101只、策勒黑羊(新疆維吾爾自治區(qū)和田市)52只、蘇尼特羊(內蒙古自治區(qū)烏拉特中旗)21只、灘羊(寧夏回族自治區(qū)鹽池縣)22只、草原型藏羊(西藏自治區(qū)當雄縣)161只，以及帶有產羔記錄的小尾寒羊(山東省鄆城縣)384 只。采抗凝血送北京康普森生物技術有限公司進行基因型檢測。

1.2 組織樣品采集

采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、輸卵管、子宮、腎臟、腎上腺等10種組織樣。樣品要在屠宰后迅速采集完成裝入2 mL RNase-Free凍存管中，立刻放進液氮中保存，所有樣品采集并保存完成后一并轉入干冰帶回實驗室，整理并保存于-80 ℃專用冰箱中。

1.3 試驗相關試劑及儀器

試驗中相關試劑主要有RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)、反轉錄試劑盒(TakaRa，寶生物工程(大連)有限公司)和熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMII) (TaKaRa, 寶生物工程(大連)有限公司)等，相關儀器有NanoDrop 2000超微量分光光度(Thermo, 美國)、PCR儀(Eppendorf, 德國)和羅氏熒光定量儀480II(羅氏, 美國)等。

1.4 引物設計

參考GenBank綿羊TPH1和TPH2基因mRNA序列(登錄號：ENSOARG00000001345和ENSOARG00000014686)及公開文獻發(fā)表的引物信息，采用Premier 3.0在線軟件進行引物設計，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。以β-ACTIN(登錄號：NM_001009784.1)作為參照基因。qPCR引物相關信息見表1。

表1 本研究所用RT-PCR引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 總RNA提取及cDNA合成

將采集的組織用RNA提取試劑盒提取總RNA，通過cDNA快速合成試劑盒反轉錄總RNA獲得cDNA。反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一條鏈。5 倍稀釋反轉錄產物后，用β-ACTIN(qPCR引物，見表1)做參照基因進行PCR檢測，質量合格后0 ℃保存以備檢測基因mRNA表達。

1.6 熒光定量PCR體系及標準曲線建立

用羅氏PCR儀檢測組織表達，每個樣品技術重復為3次，用β-ACTIN作為內參基因，以模板為H2O設空白對照。qPCR反應體系和反應程序相關試劑參照使用說明，標準曲線的建立體系和步驟方法參考文禹粱等(2019)，繪制TPH2 基因以及β-ACTIN基因的標準曲線[12]，反應結束后進行熔解曲線分析。

1.7 基因分型

對TPH2基因g.107854166 C>T和g.1078541669C>T 2個SNP位點在不同綿羊品種中進行分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(康普森生物技術有限公司，北京)進行基因型檢測。分型樣品選擇：常年發(fā)情品種(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季節(jié)性發(fā)情品種(蘇尼特羊、灘羊和草原型藏羊)。分型樣品為DNA(綿羊抗凝血提取)，每個樣品DNA需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng/μL。

1.8 數據統(tǒng)計及分析

采用2-ΔΔCt法[13]計算TPH基因在各組織中的相對表達量，數據用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析，用最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 TPH1和TPH2基因在綿羊HPGA 10種組織中的表達分析

采用qPCR技術對2 個基因在綿羊HPGA各組織中的差異表達情況進行定量分析，結果發(fā)現TPH1基因在2 個綿羊品種各組織廣泛表達(圖1)：

圖1(a)中，TPH1基因在蘇尼特羊下丘腦和松果體中短光照表達量極顯著高于長光照(P<0.01)，在蘇尼特羊垂體中短光照表達量顯著高于長光照(P<0.05)；圖1(b)中，TPH1基因在小尾寒羊垂體和卵巢中卵泡期表達量顯著低于黃體期(P<0.05)。

*代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。下同。*indicates the difference is significant (P<0.05).**indicates the difference is highly significant (P<0.01). The same below.圖1 TPH1基因在蘇尼特羊(a)和小尾寒羊(b)的相對表達量Fig.1 Relative expression of levels TPH1 gene in sunite sheep (a) and Small Tail Han sheep (b)

2.2 TPH2基因的表達水平

檢測TPH2基因在不同繁殖狀態(tài)下蘇尼特羊和小尾寒羊性腺軸相關組織中表達量發(fā)現：TPH2基因在蘇尼特羊松果體以及腎臟中表達量較高，圖1(a)中卵巢組織中長光照下的表達量顯著高于短光照(P<0.05)；圖2(b)中TPH2基因在小尾寒羊下丘腦組織中卵泡期的表達量極顯著高于黃體期(P<0.01)。

圖2 TPH2基因在蘇尼特羊(a)和小尾寒羊(b)的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of TPH2 gene in sunite sheep (a) and Small Tail Han sheep (b)

2.3 TPH2基因多態(tài)性分析

通過MassARRAY飛行質譜技術(Time-of-flight mass spectrometer, TOF-MS)[11]檢測6個綿羊品種，得到綿羊3號染色體TPH2基因第1外顯子存在2處突變：g.107854166C>T和g.1078541669C>T，并發(fā)現g.107854166C>T為錯義突變S/L(密碼子TCG/TTG)，位于TPH2基因cDNA的第149個堿基，蛋白質的第50個氨基酸；g.1078541669C>T也屬于錯義突變P/L(密碼子：CCG/CTG)，位于TPH2基因cDNA的第152個堿基，蛋白質的第51個氨基酸。同時對6 個綿羊品種TPH2基因進行基因分型，并發(fā)現TPH2基因2 個SNP位點在單羔季節(jié)性發(fā)情和多羔常年發(fā)情品種中均存在3 種基因型，并且g.107854166C>T和g.1078541669C>T位點的CC型均為優(yōu)勢基因型。

通過統(tǒng)計學比較單羔季節(jié)性發(fā)情和多羔常年發(fā)情組間6 個綿羊品種g.107854166 C>T和g.1078541669C>T的基因型和等位基因頻率差異，從表2可知，TPH2基因g.107854166C>T等位基因頻率在季節(jié)性、常年發(fā)情品種間差異達到顯著水平(P<0.05)，但其他的基因型頻率和等位基因頻率均沒有達到顯著差異水平。且CC為優(yōu)勢基因型，C為優(yōu)勢等位基因。

表2 TPH2基因不同SNP位點在季節(jié)性、常年發(fā)情品種中的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of different SNPs of TPH2 gene in seasonal and non-seasonal reproduction sheep

通過統(tǒng)計學分析TPH2基因不同SNP位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學(表3)可知，TPH2基因的g.107854166C>T和g.107854169C>T位點在灘羊、蘇尼特羊、草原型藏羊、小尾寒羊、湖羊以及策勒黑羊6個品種中均表現為低度多態(tài)(PIC<0.25)。另外，卡方適合性檢驗結果表明，g.107854166C>T在多羔常年發(fā)情品種組間均為野生型，該位點沒有發(fā)生突變，單羔季節(jié)性發(fā)情品種間g.107854169C>T位點均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。

用ANOVA將候選基因的基因型與384只小尾寒羊產羔數進行關聯分析，從表4中可知，TPH2基因g.107854166C>T和g.107854169C>T位點不同基因型與小尾寒羊3 個胎次產羔數關聯后無顯著差異。

3 討 論

3.1 季節(jié)性變化對TPH基因表達的影響

TPH1是MEL生物合成第1個限速酶，在所有脊椎動物的松果體中大量產生[14]。松果體細胞中MEL的生物合成是多步驟反應，其起始于TPH將色氨酸羥基化為5-HTP，并受到色氨酸羥化酶1(TPH1)的限制[15]。本研究發(fā)現TPH1基因在蘇尼特羊松果體中的差異表達(圖1)，也驗證了上述結果[16]。在大鼠[16]和鳥[17]等動物中檢測到TPH1 mRNA呈晝夜節(jié)律表達。在溫帶鳥類的季節(jié)性發(fā)情的研究中也發(fā)現TPH1mRNA在下丘腦乳頭狀前核(Premammillary)表達，進而控制鳥類季節(jié)性發(fā)情[17]，本研究TPH1mRNA在蘇尼特羊下丘腦和松果體中短光照表達量極顯著高于長光照(P<0.01)，受到季節(jié)性信號強烈的選擇，與Kang等[17]的研究結果一致。

TPH2基因的晝夜節(jié)律已經被多項研究證明：大鼠視網膜[16]和敘利亞倉鼠(Syrianhamster)下丘腦[18]中的TPH2轉錄本顯示出明顯的光周期依賴性晝夜節(jié)律變化。然而，在鳥類下丘腦PMM中沒有檢測到TPH2mRNA表達[17]。蘇尼特羊TPH2轉錄研究中僅在卵巢組織發(fā)現差異表達。究其原因可能是TPH2mRNA表達在蘇尼特母羊中季節(jié)性節(jié)律較弱或不存在季節(jié)性節(jié)律。

3.2 類固醇激素負反饋對TPH-GnRH通路的影響

卵巢切除后在獼猴(Rhesusmacaques)[19]、恒河猴(Rhesusmonkey)[9]和大鼠[20]下丘腦中注射E，均發(fā)現丘腦局部區(qū)域TPH2mRNA表達增加。在使用E處理后的母猴5-HT神經元中TPHmRNA和TPH蛋白單細胞水平都顯著升高，證明E可誘導5-HT神經元中的PR和ER進而參與調控5-HT的分泌，表明TPH(尤其TPH2)可能受到HPGA中的E負反饋調控[10]。在下丘腦內側視前區(qū)(Medial preoptic area)中5-HT神經元突出連接GnRH神經元，能直接負調控GnRH的分泌[2]，在雌性大鼠的GnRH神經元中發(fā)現大量的5-HT受體，其中HTR2參與調控排卵，并介導5-HT間接或者直接抑制LH分泌[2]，也證明了GnRH受到5-HT/HTR2影響[21]。研究表明大鼠中存在TPH/5-HT/5-HT受體2(5-Hydroxytryptamine receptor 2)/GnRH通路調控性腺軸激素分泌[2]。

本研究qPCR檢測結果暗示小尾寒羊下丘腦TPH表達受到雌激素正反饋和負反饋的影響。綿羊發(fā)情進入卵泡期后，孕酮濃度急劇下降，孕酮的負反饋消失，在排卵前(卵泡最大時)出現平行的LH峰和E峰，當E大量分泌時，可以通過負反饋作用于下丘腦和垂體[22]。小尾寒羊卵泡期存在E反饋，作用于HPGA，調節(jié)GnRH和LH釋放分泌[23]。綜上所述并結合本研究(圖2)中TPH2基因在小尾寒羊下丘腦組織中卵泡期的表達量極顯著高于黃體期(P<0.01)的研究結果，推測綿羊下丘腦中同樣存在通路E/TPH2/5-HT/HTR2/GnRH通路。本研究小尾寒羊卵泡期組織是在卵泡達到最大時采的樣，此時正處于雌激素峰，E大量分泌，反饋作用于下丘腦5-HT神經元的TPH2，使其表達量增加，導致5-HT分泌增多，并通過5-HT神經元末端突出作用于GnRH神經元，從而調控GnRH分泌[2]。

3.3 TPH在垂體中的作用

已有研究表明增加內源性5-HT水平導致LH分泌減少[2,24]，證明TPH可以通過5-HT調控LH水平。通過注射5-HT神經毒素破壞5-HT神經元后，在大鼠中后發(fā)現抑制5-HT合成對LH分泌的促進作用[2]。在去勢大鼠腦室注射小劑量5-HT后，LH釋放減少[25]，同時也有研究報道了全身注射5-HT對閹割大鼠LH水平的抑制作用[26]。本研究發(fā)現TPH1在小尾寒羊垂體和卵巢中卵泡期顯著低于黃體期(P<0.05)結果與上述小鼠中的研究基本一致[26]。

3.4 TPH2基因多態(tài)性與綿羊產羔數之間的關系

TPH2基因的g.107854166C>T和g.107854169C>T位點在灘羊、蘇尼特羊、草原型藏羊、小尾寒羊、湖羊以及策勒黑羊6 個品種中均表現為低度多態(tài)(PIC<0.25)，表明2 個位點在6 個綿羊品種中的遺傳多樣性較少。前者在多羔常年發(fā)情組沒有突變型，可能由于突變致死或突變型適應性差導致死亡。從表2可知這2 個位點與綿羊季節(jié)性發(fā)情無關，因此推斷這2 個位點不是影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的關鍵位點。與小尾寒羊產羔數關聯分析也表明，g.57842893C>T位點與小尾寒羊第1、2以及第3胎產羔數均無顯著關聯(P>0.05)，不是影響小尾寒羊產羔數的關鍵基因。

4 結 論

本研究發(fā)現，TPH1和TPH2基因在綿羊繁殖相關組織中呈中等豐度表達，在HPGA各組織中的生理功能不重疊。在蘇尼特羊中TPH1基因呈季節(jié)光照依賴性節(jié)律表達，可能參與綿羊季節(jié)性發(fā)情調控和繁殖時期轉換。TPH2基因可能在小尾寒羊下丘腦中受到E的反饋調控，參與發(fā)情時期的轉換。TPH2基因g.107854166C>T和g.107854169C>T位點不是季節(jié)性發(fā)情關鍵位點，也不參與小尾寒羊產羔數調控。